Стереологический и проточной цитометрии Характеристика субпопуляций лейкоцитов в моделях переходных или Постоянного церебральной ишемии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы охарактеризовать субпопуляции миелоидных клеток ишемического мозга мыши с помощью двух различных методологий. Во-первых, постоянная модель ишемии головного мозга вводится путем окклюзии как общей сонной артерии (CCA), так и дистального ствола средней мозговой артерии или инфаркта, генерирующего MCA, которые в основном поражают кору головного мозга. Затем для стереологической количественной оценки субпопуляций миелоидных клеток, серийные корональные отделы мозга подвергаются иммуноокрашиванию для интересующих клеток, а затем инфильтрированные клетки количественно оцениваются с помощью оптического фракционаторного подхода.

В качестве альтернативы, миелоидные клетки могут быть выделены из свежей ткани мозга путем механической диссоциации, а затем окрашены и проанализированы с помощью проточной цитометрии. В конечном счете, точная количественная оценка и детальная качественная характеристика конкретных субпопуляций миелоидных клеток, которые проникают в мозг мыши после церебральной ишемии, могут быть достигнуты с помощью стереоколичественного определения и мультипараметрической проточной цитометрии соответственно. Основное преимущество данной серийной модели ишемии перед другими существующими заключается в том, что наша методика имеет значительно более низкие показатели смертности, чем другие методы, что позволяет минимизировать количество животных, необходимых для исследования.

Эта область может помочь ответить на ключевые вопросы в области инсульта, например, какова роль микрореактивации, экстравазации гематогенных макрофагов или нейтрофилов при травме головного мозга? Они дают точную теологическую оценку мультипараметрической цитометрии, продемонстрированной в этой статье, и могут дать представление о количестве, фенотипе и функции популяции миелоидных клеток как в врожденном иммунном ответе на ишемию КЭ. Чтобы сначала перевязать ОСА, сделайте разрез по средней линии в один сантиметр вокруг вентральной поверхности шеи животного под хирургическим микроскопом.

После рассечения используйте шов из нейлона с шестью нулями, чтобы окклюзировать левый CCA постоянным узлом, чтобы перевязать дистальный MCA. Далее сделайте горизонтальный разрез на височной мышце справа налево. Затем сделайте второй вертикальный разрез с правой стороны височной мышцы.

Следите за тем, чтобы не перерезать височную вену. Оттяните височную мышцу от черепа и затяните ее швом, чтобы сохранить чистую поверхность черепа. Затем очистите череп холодным стерильным физиологическим раствором, чтобы определить точное положение левого MCA с помощью прозрачности черепа.

После того, как MCA будет идентифицирована, с помощью жернова из нержавеющей стали выполните круглую трепанацию черепа диаметром в один миллиметр в лобной доле между скуловой дугой и чешуйчатой костью. Осторожно удалите череп, обнажив MCA. Затем используйте нейлоновый шов с девятью нулями, чтобы окклюзировать левый MCA в дистальном отделе туловища непосредственно перед бифуркацией между лобной и задней ветвями MCA постоянным узлом.

Чтобы удалить мозг, обезглавьте усыпленную мышь чуть выше спинного мозга и сделайте задний передний разрез на коже, чтобы обнажить череп. Затем сделайте два боковых надреза на стыке боковых стенок и основания черепа и удалите небольшой кусочек кости. Далее сделайте разрез через череп по сагиттальному шву и с помощью щипцов удалите череп над каждым полушарием, чтобы обнажить мозг.

С помощью шпателя отделите мозг от черепа и переведите его в 4% раствор PFA. Через три часа удалите PFA и инкубируйте мозг в 30% растворе сахарозы для криозащиты мозга. Через 48 часов удалите раствор сахарозы и быстро заморозьте мозг при температуре минус 40 градусов по Цельсию, а затем с помощью замораживающего микротома сделайте 30-микрометровые корональные срезы мозга.

Собираем 10 серийных наборов в криоконсервирующем растворе. Каждый последовательный набор состоит примерно из 14-16 корональных срезов с расстоянием между срезами 300 микрометров. Обеспечить адекватную выборку мозга мыши в диапазоне от 1,94 до отрицательных 2,46 после bgma для оценки общего количества инфильтрированных нейтрофилов.

После окклюзии MCA оптическим фракционатором сначала иммуноокрашивают нейтрофилы антителом крысы anti LY six G и соответствующим вторичным антителом на плавающих срезах с помощью обычного метода иммунофлуоресценции. Затем установите срезы мозга на предметные стекла микроскопа Super Frosts с областью инфаркта, расположенной справа, и откройте программное обеспечение стереоисследователя. Далее нажмите на меню менеджера серийных разделов инструментов и добавьте новый раздел кнопкой «Новый раздел».

Установите интервал оценки равным 10 для одной 10-й доли выборки среза. Затем в меню «Контур вниз» выберите инструмент «Контур инфарктированной области». Нарисуйте контур, чтобы очертить область инфаркта под объективом 10 крат.

Затем переключитесь на объектив 100x на микроскопе и в меню объективов. Чтобы количественно оценить нейтрофилы в меню зондов, теперь выберите оптический фракционатор и установите расположение подсчитывающих кадров XY на 230 для размеров сетки X и Y. Теперь выберите кнопку нейтрофилов на панели маркеров и отметьте окрашенные нейтрофилы в области инфаркта.

Экспортируйте результаты количественной оценки в файл электронной таблицы, чтобы диссоциировать мозг на суспензию одной клетки. После удаления мозга, как показано только что на рисунке, рассеките ядро и участки ипсилатеральной коры от мозга ишемизированной мыши с мозгом. Взвесьте мозговую ткань и поместите ее в пять миллилитров ледяного RPMI на один вызов для нормализации между экспериментальными группами, а затем используйте тканевую мельницу с тефлоновыми пестиками, чтобы диссоциировать ткань на одну клеточную суспензию.

Переложите клеточные суспензии в ультрацентрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и добавьте к образцам еще пять миллилитров раствора RPMI per call. Затем после центрифугирования клеточные суспензии в течение 30 минут при 7 800 GS и 25 градусах Цельсия. Убедитесь, что в верхней части раствора появился слой белого цвета, соответствующий миелину.

Осторожно удалите слой миелина и отфильтруйте всю клеточную суспензию, включая гранулированные клетки, через нейлоновое сетчатое ситечко толщиной 40 микрометров. Промойте ситечко 10 миллилитрами RPMI, чтобы убедиться, что все клетки отфильтрованы через сетку, а затем перелейте раствор в 50-миллилитровую пробирку. Добавьте в клетки 20 миллилитров RPMI, а затем после раскрутки клеток повторно суспендируйте лейкоцитарную гранулу.

В одном миллилитре PBS инкубируют клетки в течение двух-трех минут в четырех миллилитрах лизисного буфера при комнатной температуре, чтобы лизировать эритроциты, а затем раскрутить вниз клетки. Пометьте клетки 200 микролитрами PBS, содержащими 1% BSA и соответствующие антитела, на льду. Затем через 45 минут промойте образцы одним миллилитром холодного PBS и восстановите суспендию гранул в 100 микролитрах проточного буфера для проточного цитометрического анализа.

Эта модель характеризуется высоковоспроизводимыми объемами инфаркта через 24 часа после окклюзии средней мозговой артерии по методу Кавальери. В ниальных окрашенных срезах, в соответствии с предыдущими исследованиями, инфильтрация нейтрофилов напрямую коррелирует с размером инфаркта. Кроме того, выделение лейкоцитов и проточная цитометрическая характеристика позволяют выделить миелоидные клетки из коры пораженного IPS полушария ишемизированных мышей, которые составляют от 10 до 30% от общего числа событий, обнаруженных в клеточной суспензии, и имеют низкий параметр прямого рассеяния, связанный с клеточным мусором.

CD 11 B положительные клетки имеют более высокое значение прямого рассеяния, что позволяет предположить, что клеточный мусор не помечен этим маркером и, как указывалось ранее, его можно исключить из дальнейшего анализа, установив порог FSC на уровне 200 нейтрофилов, характеризуемых как LY шесть G-положительных клеток, являются наиболее многочисленной инфильтрированной клеточной популяцией, обнаруженной через 24 часа после окклюзии MCA в ишемизированном мозге мыши, использующей эту модель церебральной ишемии и составляют от 70 до 80% CD 11 B положительного CD 45 высоких клеток. Остальные клетки в основном представляют собой субпопуляцию CD 11 B, положительного CD 45, высокого LY 6 G, отрицательного 6 C провоспалительных моноцитов, которые обнаруживаются в повышенном количестве в ишемизированных областях мозга от 24 до 48 часов после окклюзии средней мозговой артерии. Эта модель P-M-C-A-O может быть выполнена за 30 минут, если она выполнена правильно после процедуры проточной цитометрии.

Другие методы, такие как сортировка определенного подмножества клеток, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каковы паттерны экспрессии, метаболические изменения или уксусная активность миелоидных клеток в этой модельной системе. После просмотра этого видео просто чтобы иметь хорошее представление о том, как создать модель ишемии и, самое главное, как охарактеризовать количество и фенотип инфильтрирующих миелоидных клеток двумя различными подходами в мышиной черепно-мозговой травме или модели ТПЭ после ишемии цере.