Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки мышечной дистрофией пациентов: эффективная интеграция без перепрограммирования мочи клеток, полученных

Общая цель данного эксперимента заключается в эффективном получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или IPSC у пациентов с мышечной дистрофией, начиная с клеточных культур, полученных из мочи, и метода перепрограммирования без интеграции. Это достигается путем предварительного сбора образцов мочи у пациентов с мышечной дистрофией. На втором этапе клетки мочи изолируют и расширяют в клеточные культуры, полученные из мочи.

Затем клетки, полученные из мочи, трансдуцируются вирусом Сендай, содержащим факторы Яманака, и через 12 дней появляются типичные плюрипотентные колонии. В конечном счете, к концу 13 свободное от трансгенов состояние плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждено с помощью анализа R-T-P-C-R. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как перепрограммирование изолированных фибробластов кожи с использованием лентивирусных векторов, заключается в том, что с помощью этого метода соматические клетки могут быть получены неинвазивным путем от пациентов и использованы для эффективного создания ИПК с использованием метода вирусного перепрограммирования с нулевым следом.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мышечной дистрофии, например, как эти состояния могут быть смоделированы in vitro без опасений по поводу безопасности для применения человеком. Процедуры будут демонстрировать Мохаммад Зишан Ал, постдокторант Кортни Гестинг, техник, и аспирантка Мелани Райдер, все трое из моей лаборатории. Когда пациент будет готов, выдайте ему набор для сбора мочи, содержащий следующие предметы, письменные инструкции о том, как получить стерильные или чистые, более захватывающие и пробные влажные антибактериальные туалеты, а также 100-миллилитровый стерильный стаканчик для сбора образцов.

Когда проба будет собрана, немедленно поместите стаканчик для сбора на лед и перенесите образец в лабораторию в холодильник. Затем с помощью стерильных пипеток переложите образец мочи в стерильные центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров и вращайте пробирки при 400-кратном перегрузке в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем в BSL два бокса биологической безопасности аспирируют все, кроме последнего, миллилитр надосадочной жидкости, стараясь не повредить гранулу.

Затем промойте ячейки в семи миллилитрах промывочного буфера и снова открутите ячейки. На этот раз отсасывая все, кроме последнего, примерно от 0,2 до 0,5 миллилитров надосадочной жидкости. Теперь повторно используйте гранулу в двух-трех миллилитрах мочевых клеток-предшественников или среды UPC и перенесите суспензию в четыре-шесть лунок 24-луночного планшета без покрытия через 72 часа, дополните культуру 0,5 миллилитрами свежей среды UPC на лунку.

Следите за культурой в течение четырех-шести дней инкубации. Должны начать появляться небольшие двух-четырехклеточные колонии округлых или удлиненных клеток, представляющих эпителиальные клетки первого или второго типа соответственно. Продолжайте менять среду каждые два-три дня.

Поскольку колонии пройдут фазу быстрого роста примерно через 9-15 дней культивирования, клетки должны быть на 80-90% слитыми на этом этапе, разделите клетки на две-четыре лунки 24-луночной пластины для дальнейшего расширения. Помечая эту культуру как пассаж один, клетки мочи затем могут быть охарактеризованы по маркерам, специфичным для линии, с помощью проточного цитометрического анализа, иммуногистохимического окрашивания или с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой, чтобы обеспечить высокоэффективное перепрограммирование за несколько дней до затравки трансдукции, 60 000 клеток на лунку. Из прохода от одной до пяти культур в две лунки с шестилуночной пластиной в нулевой день.

Приготовьте Сендайский вектор перепрограммирования, добавив каждый из четырех факторов OSKM в подходящую для перепрограммирования MLI к одному миллилитру предварительно разогретой среды UPC, аспирируйте подстрекательную среду и медленно добавляйте вирусную суспензию в одну лунку клеток мочи в течение следующих шести дней. Ежедневно заменяйте надосадочную жидкость свежей средой UPC на пятый день, обработанные семенами митомицина, на покрытые желатином 100-миллиметровые квадратные чашки для культуры на шестой день. Диссоциируйте клетки мочи с помощью трипсина, ресуспендируйте их в среде UPC и положите их в пять раз по 10 четвертых до двух умножить на 10 пятых клеток на пластину подачи метамфетамина.

На следующий день замените среду UPC на человеческую эмбриональную стадию или среду HES и наблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы наблюдать за трансформированными клетками в течение примерно 12-18 дней. После трансдукции клетки должны образовывать клональные агрегаты с характерной морфологией булыжника и более высоким соотношением ядра к цитоплазме. Чтобы идентифицировать перепрограммированные клоны IPSC, выполните окрашивание живых клеток на антитело TRA 180 1.

Затем с помощью полудюймовой иглы 26 калибра заштрихуйте положительные клональные агрегаты TRA 180 1 на четыре-шесть небольших частей одинакового размера на клон. Затем с помощью стерильного наконечника для пипетки выберите и перенесите от 10 до 20 заштрихованных деталей из нескольких клонов в каждую лунку Планшет с 24-луночным покрытием и HESC. Среда, через 24-48 часов после нанесения перепрограммированных клонов на поверхность матрицы.

Замените носитель на носитель IPSC. Используйте наконечник для дозатора для ручного соскабливания любых дифференцированных клеток или загрязняющих клеток питателя метамфетамина, чтобы помочь в очистке полностью перепрограммированных и плюрипотентных дистрофических клонов IPSC. После того как клоны достигнут размеров около 100 мкм, диссоциируют клетки с ЭДТА в течение трех минут, а затем помещают небольшие клеточные агрегаты перепрограммированного дистрофического IPSC, суспендированные в среде IPSC с добавлением ингибитора RO-киназы на свежую пластину из 12 фольги, покрытую матригелем.

Наконец, подтвердите плюрипотентность каждого клона с помощью анализа экспрессии генов и иммуногистохимического окрашивания. Что касается плюрипотентных маркеров, то большинство клеток, выделенных из мочи человека, положительны на маркеры предшественников и стволовых клеток, такие как CD 44, CD 73 и CD 1 46. Клетки также демонстрируют мезенхимальные маркеры, такие как альфа-гладкомышечный актин и ментон.

R-T-P-C-R выделенных клеток свидетельствует о смешанной популяции клеток в культурах. При этом наблюдается слабая экспрессия цитокератина семи и одного маркера А и трех маркеров А евроэпителиальных клеток. Клетки мочи превращаются из удлиненных клеток второго типа в нулевой день в булыжник к четвертому дню перепрограммирования.

К 12-му дню наблюдаются типичные плюрипотентные клоны, способные сохранять свою плюрипотентную морфологию в условиях отсутствия фидеров. Окрашивание живых клеток для TRA 180 1 может быть использовано для идентификации перепрограммированных клонов. Для подтверждения генерации векторных и трансгенных, свободных плюрипотентных клонов, R-T-P-C-R может быть выполнен с использованием праймеров против генома вируса Сендай и каждого из экзогенных факторов OSKM.

Экспрессия экзогенных генов больше не обнаруживается по пассажу 13, но можно наблюдать повышение регуляции эндогенных факторов. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтверждает экспрессию плюрипотентных маркеров на ПИИК, но не на клетках мочи. Экспрессия белка и гена дистрофина может быть затем проверена с помощью дальнейшего иммунофлуоресцентного окрашивания, вестерн-блоттинга и R-T-P-C-R соответственно, как показано на этих репрезентативных изображениях из контроля дикого типа и дистрофических клеточных линий.

После освоения этот метод может быть использован для достижения свободного перепрограммирования ucs. В течение нескольких недель после этой процедуры мы можем дифференцировать ИПК на кардиомиоциты или скелетные миоциты, чтобы улучшить механизмы мышечной дистрофии.