Выделение различных клеточных популяций из развивающихся мозжечка микродиссекции

Общая цель этой процедуры заключается в выделении определенных клеточных популяций из развивающегося мозжечка. Это достигается путем первого сбора мозжечка у неонатальных мышей, несущих флуоресцентные белки. Вторым этапом процедуры является получение срезов живых тканей с помощью вибрато.

Третьим этапом является микродиссекция наружного зародышевого слоя мозжечка под флуоресцентным препарирующим микроскопом. Заключительными этапами являются диссоциация ткани в одноклеточную суспензию и сбор клеток с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток. В конечном счете, результаты могут показать, что определенные клеточные популяции могут быть выделены из мозжечка.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как лазерный захват, микродиссекция, заключается в том, что клетки являются живыми и могут быть культивированы. Для дальнейших экспериментов Для этой процедуры простерилизуйте хирургические инструменты с помощью автоклава. Приготовьте свежий или повторно нагретый с низким уровнем плавления 3% на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

Подберите необходимые растворы для диссоциации клеток на основе папайана. Приготовьте свежие питательные среды NBB 27. Затем профильтровать, простерилизовать и хранить в инкубаторе.

Подготовьте буфер факса и подготовьте обложки из поли-де-лицина. Первый слой автоклавного покрытия содержит 100 микрограммов поли-делицина на миллилитр стерильной воды. Затем выдерживают крышку в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия или в течение ночи при комнатной температуре.

Позже промойте защитные стекла дистиллированной водой, а затем нанесите на них фильтрующий материал NBB 27 перед использованием защитных стекол. Полностью высушите их. Это займет не менее часа, прежде чем начать.

Сначала подготовьте область рассечения. Протрите его 70% этанолом. Затем накройте его впитывающей салфеткой.

Во-вторых, извлеките инструменты из стерилизационного пакета и расположите их для использования. В-третьих, загрузите в тарелку ледяной стерильный ДПБС с 1%-ной полоской ручки и поставьте ее на лед. Препарируйте мозг щенка P 4, который экспрессирует флуоресцентные маркеры.

Затем переложите его в подготовленную посуду DPBS. С помощью щипцов аккуратно отделите мозжечок от остального мозга. Эти мозжечники экспрессируют маркеры math one, GFP и гнездо в CFP, в котором EGL экспрессирует GFP, а молекулярный слой положителен для CFP.

Затем заполните двухсантиметровую кубическую форму для заделки агрораствором. Следите за тем, чтобы было не теплее 37 градусов по Цельсию. Возьмите мозжечок перфорированной ложкой и промокните его насухо, аккуратно промокнув тканью.

Затем с помощью щипцов установите его в форму. Используйте иглу, чтобы привести мозжечок в вертикальное положение. Один раз около четырех загружаются в форму.

Поместите форму на лед, чтобы она быстро застыла с помощью лезвия бритвы. Обрежьте блок, чтобы сократить время секционирования. Затем приклейте блок к пластине, ориентированной так, чтобы мозжечок был вертикальным.

Загрузите лоток для наполнения ледяным DPBS с 1%-ным ремнем и положите лед под противень, чтобы он оставался холодным. Теперь секционируем блоки с помощью вибратора. Разрежьте и соберите срезы размером 600 микрон.

Выньте их из лотка для льда с помощью перфорированной ложки и переложите в наполненную A-D-P-B-S форму со льдом. Под флуоресцентным пресекающим микроскопом. Осмотрите ломтики как можно быстрее.

Аккуратно отделите EGL от остальной части мозжечкового отдела. Используйте тонкие щипцы для рассечения между положительным молекулярным слоем CFP и GFP-положительным EGL. Будьте очень осторожны во время микродиссекции, чтобы избежать загрязнения из соседних областей.

Перенесите GFP-положительную ткань EGL в новую чашку, наполненную DPBS, на льду. Избегайте включения каких-либо тканей молекулярного слоя, так как это приведет к загрязнению культуры гнездовыми элементами, экспрессирующими глию Бергмана. Далее удалите агрос, окружающий изолированную ткань EGL.

Теперь EGL может быть диссоциирован с помощью протокола на основе paan для суспензии одной клетки. Когда это будет завершено, выполните операционную приостановку ячеек в буфере факса. Продолжите сбор элементов CFP с помощью факса.

Отсортируйте их с помощью высокоскоростного цитометра и фильтра CFP и поместите в ледяной буфер для факсов. На Р-4 мозжечок должно быть получено около 100 000 NPS. Затем центрифугируйте объединенные клетки при давлении 300 G в течение пяти минут.

Немедленно используйте клетки для их культивирования. Подвесьте их в предварительно прогретых носителях NBB 27. Затем загрузите их на защитные колпачки, покрытые поли D лизином.

Срезы клеточной беллы готовили из P четырех мат одного гнезда GFP у мышей CFP. Мозжечковый EGL содержал в основном GFP, экспрессирующие GMP, и мог быть легко отделен от молекулярного слоя, обогащенного CFP, экспрессирующим глию. Анализ фактов показал, что более 85% клеток в EGL были обычными GNP. NEP были выделены из глубоких частей EGL путем микродиссекции с последующим предоставлением фактов.

Эти клетки составляли около 5% клеток в EGL за четыре дня культивирования. Факты выделения NPS привели к появлению нейронов, экспрессирующих бета-тубулин. Это характерно для клеток-предшественников нейронов, ограниченных по линии.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости работать быстро и как можно дольше держать ткань на льду.