Сублингвальной иммунотерапии как альтернатива Вызвать защиты от острыми респираторными инфекциями

Общая цель этой процедуры заключается в использовании сублингвальной иммунотерапии для усиления врожденного иммунного ответа в легких и обеспечения комфортной защиты от смертельной пневмококковой пневмонии. У мышей первый шаг заключается во введении раствора с иммуностимулирующим агентом в подъязычную слизистую оболочку мыши, находящейся под наркозом. Затем суспензия, содержащая смертельную дозу генного штамма стрептококковой пневмонии, закапывают интраназальным корнем мышам под наркозом, предварительно получавшим флэтлайн или физиологический раствор в качестве контроля.

Бронхо биларный проводится для анализа субпопуляции, инфильтрирующей дыхательные пути и легочную ткань, обрабатывается с целью получения одноклеточной суспензии для фенотипической характеристики клеточной популяции. С помощью многопараметрической проточной цитометрии нижней челюсти добавочные лимфатические узлы нижней челюсти, а также сублингвальная ткань также могут быть обработаны для выполнения проточной цитометрии или другого последующего анализа. Популяции клеток, проникающие в дыхательные пути.

Легкие или подъязычная слизистая оболочка могут быть идентифицированы с помощью иммунного фенотипирования и многопараметрической проточной цитометрии Иммунная активация в различных тканях после сублингвальной иммунотерапии также может быть проанализирована путем изучения профиля транскрипции с помощью ПЦР в реальном времени. Добро пожаловать в Лабораторию по исследованию вакцин на факультете биотехнологии, которую мы выделяем школе медицины Университета У.Одним из основных интересов нашей лаборатории является создание новых стратегий иммунного вмешательства против респираторных инфекций. Интерназальный путь был успешно использован для доставки иммуностимулирующих агентов для лечения или профилактики инфекции легких или других теологий.

Мы показали, что интраназальный ввод лин, компонент бактериального геля, может быть эффективно использован при нарушенной инфекции легких, вызванной мышами STO. Несмотря на то, что интраназальный корень обычно требует низкой дозы терапевтического агента и вызывает сильную реакцию в дыхательных путях, он имеет некоторые недостатки, такие как возможность токсичности для центральной нервной системы и паралич фации, связанный с абсорбцией иммуностимулирующих соединений через ораторские нервы. Таким образом, мы создали модель иммунотерапии УАЛ в качестве альтернативы для индуцирования защитного иммунитета против пневмококковой пневмонии.

Сублингвальная иммунотерапия предлагает более безопасную альтернативу по сравнению с интраназальной установкой. Он неинвазивный, безболезненный и простой. Хотя для этого могут потребоваться более высокие дозы терапевтического средства, его можно использовать для доставки NA или фармацевтических продуктов, чтобы в конечном итоге модулировать иммунный ответ в длину.

Теперь мы покажем вам, как проводить сублингвальное введение у мышей с использованием лестного средства в качестве терапевтического средства. Субиновая иммунотерапия может в конечном итоге защитить мышей от смертельной интраназальной инфекции со стрептококковой пневмонией, вызывая врожденный иммунный ответ в легких. Мы также рассмотрим характеристику длины, врожденного ответа во время инфекции и после сублингвальной иммунотерапии с использованием проточной геометрии и ПЦР в реальном времени.

Наконец, мы покажем вам, как собрать локальные зернистые лимфатические узлы и подъязычную ткань для дальнейшего анализа. После приготовления исследуемого раствора стимулирующего средства провести обезболивание животных путем введения 200 микролитров раствора Кетамина OSI методом Interperitoneal Injection Pet раствора, содержащего иммуностимулятор в максимальном объеме 10 микролитров. Затем возьмите мышь левой рукой и удерживайте ее большим и указательным пальцами свободной руки.

Аккуратно подложите закрытые щипцы под язык и удерживайте его на месте. Средним и безымянным пальцами возьмите пипетку и нанесите раствор на дно рта и тыльную сторону языка. Снимите щипцы и дайте рту отдохнуть в течение трех-пяти минут, прежде чем положить его обратно в клетку.

Ключевыми особенностями этой методики являются общий объем, используемый для лечения животных, и анестезия. Небольшие размеры ротовой полости мышей ограничивают максимальный объем, который может быть нанесен на сублингвальное соотношение, до 10 микролитров. После того, как вы определились с дозой, вы должны отрегулировать концентрацию образца до этого максимального объема.

Большие объемы могут привести к нежелательному проглатыванию или аспирации раствора. Анестезия имеет решающее значение для того, чтобы избежать глотания и обеспечить проникновение веществ через эпителий. Мы советуем вам не использовать ингаляцию для анестезии, так как мыши проснутся слишком рано.

Обратите внимание, что некоторые инъекционные анестетики могут вызывать слюноотделение у мышей. Если это произойдет, используйте небольшой кусочек бумаги для устранения чрезмерного слюноотделения перед нанесением раствора с терапевтическим средством, дозу терапевтического средства следует скорректировать, чтобы максимизировать его эффект, и настоятельно рекомендуется протестировать несколько доз. Если вы ранее использовали соединение через интраназальный корнеплод, доза в пять-десять раз выше будет хорошей отправной точкой для тестирования.

Испытайте ваше терапевтическое средство по подъязычному корню. Обратите внимание, что абсорбция через эпителий будет ограничена размером молекулы, разморозьте аликвоту заранее подготовленного рабочего состава Streptococcus pneumonia известного бактериального номера КОЕ центрифугируйте в течение пяти минут при 2 500 Gs и выбросьте суспензию в одном миллилитре стера физиологического раствора и центрифуги. Опять же, выбросьте надосадочную жидкость и отдохните.

Суспензировать гранулу в соответствующем объеме стерильного физиологического раствора до получения суспензии в четыре раза по 10 до пяти КОЕ в 50 мкл, что соответствует минимальной бактериальной дозе используемого серотипа, вызывающего 100% смертность в луковице С. Мышам взять 50 мкл бактериальной суспензии и осторожно закапать весь объем в ноздри мыши, ранее обезболившей ее. Удерживайте мышь в вертикальном положении в течение двух минут и дайте ей отдохнуть в тыловом положении еще две минуты. После проведения испытания подтвердили номера КОЕ в бактериальной суспензии, выполнив серийное десятикратное разведение суспензии и нанеся их на кровь.

Агаровая тарелка Инкубировать в течение ночи при температуре 37 градусов с 5% CO2 слизи. Колонии этноса можно отличить по характерному для альфа-гемолитических бактерий зеленому ало. Подсчитывайте колониеобразующие единицы и регистрируйте использование провожающей дозы.

После усыпления животного откройте грудную полость до самой шеи. Сделайте разрез вдоль передних ног, чтобы обнажить трахею и подъязычную область. Определите нижнечелюстные лимфатические узлы.

Обычно они представляют собой беловатые структуры овальной формы, расположенные над слюнными железами. С помощью щипцов с тонким изгибом кончика аккуратно подтяните подъязычную ткань и обнажите тыльную сторону дна рта. Возьмите нижнечелюстные лимфатические узлы, осторожно подтягивая щипцами с тонким кончиком ядра, чтобы освободить их от тканей.

Поместите их в пробирку, содержащую C-R-P-M-I или раствор консерванта нуклеиновых кислот в соответствии с последующей процедурой. Это будет осуществлено позже. Теперь определите более мелкие лимфатические узлы, расположенные глубже по обе стороны горла, и удалите их.

Это добавочные нижнечелюстные лимфатические узлы. Откройте грудную полость, чтобы обнажить легкое и удалить тимус. Разрежьте нижнюю бинну CVA и удалите излишки крови с помощью абсорбирующей ткани для проведения бронхопромывания кишечника.

Во-первых, обнажите трахею. Затем сделайте небольшой надрез скальпелем и введите тонкий кончик. Переведите пеппе, предварительно заполненный одним миллилитром PBS без кальция и магния плюс одним миллимоляром EDA Осторожно закапайте и аспирируйте общий объем не менее трех раз.

Затем отсадите и перенесите клеточную суспензию в стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Перфузируйте легкие, вводя пять миллилитров PBS без кальция и магния плюс один миллимолярный ЭДТА в правый желудочек сердца, чтобы устранить все эритроциты и иммунные клетки, присутствующие в легких, кровеносных сосудах. Если перфузия была выполнена правильно, цвет легких изменится с розового на белый.

Удалите сердце, возьмите перфузные легкие и поместите их в полную среду или раствор консерванта нуклеиновых кислот в зависимости от проводимого анализа. Если вы хотите проанализировать популяцию клеток в подъязычной слизистой оболочке, изолируйте голову животного и удалите слюнные железы и прикрепите мягкие ткани. Сделайте разрез с каждой стороны рта, пока не дойдете до нижнечелюстного сустава, и отделите нижнюю челюсть вместе с языком и дном рта.

С помощью пары тупых щипцов из крысиных зубов подтяните язык вверх и сделайте надрез там, где основание языка встречается с дном рта. Эта область представляет собой подъязычную слизистую оболочку. Разрежьте и удалите язык с помощью биопсийного перфоратора, щипцов и ножниц.

Вырежьте подъязычную слизистую ткань и поместите ее в чистую пробирку. Переложите легкие на 24 лунки и выложите их чистыми ножницами. Добавьте один миллилитр среды для пищеварения, пипетируя вверх и вниз несколько раз, и инкубируйте при температуре 37 градусов и 5% CO2 в течение 40 минут после инкубации.

Снова пипетируйте вверх и вниз, чтобы убедиться, что большая часть клеток была высвобождена из ткани. Переложите клеточную суспензию на сетчатое ситечко с ячейками 40 микромеш и промойте пятью миллилитрами ПБА. Пятимиллимолярная центрифуга ЭДТА при 2, 500 GS пять минут.

Ройс суспензирует клетки в одном миллилитре факса ЭДТА, составленном из ПБС без кальция, магния, одного миллимолярного ЭДТА и 1% фетальной сыворотки. Возьмите QU и сделайте двукратное разведение клеток с помощью трипа и синего и посчитайте суспензию клеток Реуса до концентрации в два раза по 10 до семи клеток на миллилитр и добавьте 50 микролитров на пробирку. Добавьте 50 микролитров двукратной смеси антител в каждую пробирку для иммунофенотипического анализа.

Выдерживать 30 минут на льду в темноте, предварительно трижды промыв фактами. ЭДТА ресуспендирует клетки в 200 микролитрах ЭДТА и анализирует в цитометре ту же процедуру для анализа клеточной популяции в сублингвальной ткани с использованием пищеварительных сред, содержащих это пространство. Сублингвальная иммунотерапия коллагеназой и DS one с использованием очищенного flatline, агониста TLR 5 и LC 4, индуцировала значительное повышение уровня мРНК хемокинов и цитокинов, участвующих в рекрутировании нейтрофилов в легких.

Это наблюдалось и во время заражения. Рекрутирование ПМН в легкие было подтверждено с помощью проточной цитометрии. Сублингвальное лечение пятью агонистами TLR коррелировало с увеличением выживаемости животных и защитой от пневмококковой пневмонии.

Мы показали, что сублингвальная иммунотерапия является эффективным средством индуцирования защиты в линиях против инвазивной пневмококковой пневмонии ПНЭ. Это было достигнуто путем сублингвальной установки лаина, портного с пятью агонистами, которые не вырабатываются при гистопневмонии. Сублингвальная установка lain индуцировала апрегуляцию хемокина C Xcl L в линиях, а также инфильтрацию нейтрофилов.

Тип клеток, которые имеют решающее значение для элиминации пневмококковой сублингвальной иммунотерапии агонистами TLR, может быть использован для лечения инфекций отдельно или в сочетании с современными методами лечения, такими как лечение антибиотиками, чтобы предотвратить бактериальную диссемицию и развитие тяжелых форм инфекции. Сублингвальный корень также может быть использован для доставки вакцины, и было показано, что он эффективен для индуцирования слизистой, а также системного защитного иммунитета. Эта стратегия представляет особый интерес в случае респираторных инфекций и особенно для бро-пневмонии, поскольку она может не только предотвратить основное заболевание, но и колонизацию асала, блокируя бактерии при входе в спорт.

В целом, мы считаем, что сублингвальный путь является привлекательной альтернативой для разработки новых стратегий лечения или профилактики респираторных инфекций. Мы рекомендуем вам попробовать эту технику.