Выражение флуоресцентных белков Branchiostoma lanceolatum По мРНК инъекций в неоплодотворенных ооцитов

Мы сообщаем здесь надежную и эффективную экспрессию флуоресцентных белков после инъекции мРНК в неоплодотворенные ооциты в Branchiostoma lanceolatum. Развитие техники микроинъекции в этом базальной хордовых проложит путь для далеко идущих технические новшества в этой новой модельной системе, в том числе в естественных изображений и геноспецифических манипуляций.

Общая цель этой процедуры заключается во введении мРНК, кодирующей флуоресцентный белок, в ооциты бронхосной стомы lancia latam для обеспечения флуоресцентной визуализации развивающихся эмбрионов in vivo. Это достигается путем сначала, вызывая нерест зрелых самцов и самок путем температурного шока в течение 24 часов. После температурного шока самок и самцов помещают в отдельные нерестовые чаши, что позволяет собирать соответственно ооциты и сперму.

После того, как циты выстроены в линию в чашке, покрытой полилизином, специально подготовленная игла для микроинъекций используется для введения раствора внутрь ядра цита. Заключительным этапом является оплодотворение клетки от одной до пяти капель спермы. В конечном итоге двухфотонное лазерное сканирование.

Микроскопия используется для того, чтобы показать повсеместную экспрессию флуоресцентных белков, полученных из микроинъекционной мРНК. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы микроинъекции трудно освоить из-за необходимых технических навыков, которые невозможно детализировать и осветить в печати. Для начала приготовьте посуду, покрытую полилизином, которая используется для иммобилизации цитов во время инъекции.

Для каждой 35-миллиметровой клеточной культуры чашку Петри залейте дно раствором полилизина и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее перелейте раствор полилизина в другую посуду и снова выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. Слейте раствор и дайте чашкам Петри высохнуть вверх дном при комнатной температуре в течение двух часов.

В сухом состоянии посуду с покрытием хранят завернутую в полиэтиленовую пленку при температуре четыре градуса Цельсия до одной недели. Для приготовления арос покрытой посуды используется культивирование инъекционных эмбрионов, изготовление искусственной морской воды и обратного осмоса воды. Затем растворите арос до концентрации 1% в отфильтрованном SW, быстро вылейте теплый раствор ароса из одной чашки Петри в другую, чтобы обеспечить очень тонкое покрытие чашки.

Заверните покрытую глазурью посуду в саранский обертку и храните при температуре четыре градуса Цельсия до одной недели. Сначала приготовьте смесь для инъекций с РНК и свободным фенолом в воде с ДНК. Красный цвет окрашивает раствор и позволяет идентифицировать успешно введенные эмбрионы.

Затем центрифугируйте смесь, чтобы гранулировать кристаллы и держать на льду до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Когда все будет готово, загрузите в пипетку объемом 10 микролитров 0,5 микролитра инъекционной смеси, избегая дна пробирки, где были гранулированы кристаллы. Засыпьте инъекционную иглу пипетированием в 0,5 микролитра инъекции.

Перемешайте в большое отверстие иглы. Подготовьте две иглы на случай, если одна сломается во время инъекции. Храните иглы в банке с водой на дне, чтобы предотвратить испарение инъекции.

Перемешайте и поставьте при температуре четыре градуса Цельсия. Дайте инъекционной смеси медленно перемещаться к кончику инъекционной иглы в течение как минимум одного часа, чтобы свести к минимуму образование пузырьков. Чтобы начать сбор ооцитов и спермы, самцов и самок подвергают шоку в SW в течение 24 часов, а затем пересаживают в отдельные чашки за один-два часа до нереста.

По нересту сразу же собирают сперму и циты. Следите за тем, чтобы не напугать взрослых особей во время сбора. Дополнительное движение может рассеяться и, следовательно, разбавить как сперму, так и циты после сбора.

Храните сперматозоиды на льду в пробирке объемом 1,5 миллилитра и переносите циты в отфильтрованном SW в предварительно промытые чашки Петри. Перенесите от 100 до 500 цитов в другую 35-миллиметровую чашку Петри для выполнения инъекций. Наконец, оплодотворите оставшуюся часть клеточной кладки в качестве контроля качества спермы и цита или для других экспериментов.

Чтобы начать процедуру инъекции, установите иглу на микроманипулятор под углом 50 градусов относительно горизонтальной плоскости под флуоресцентным препарирующим эндоскопом с 25 эксокулярами, перенесите 30 цитов в чашку, покрытую полилизином, и отфильтруйте SW, чтобы помочь отслеживать введенные циты. Расположите их вдоль линии в упорядоченном порядке. Всегда вводите небольшие цифры, чтобы свести к минимуму воздействие.

Время до полилизина, который имеет свойство деформировать развивающиеся эмбрионы. Используйте освещение темным полем, чтобы сделать циты как можно более прозрачными. Затем с помощью ручки грубого движения поднесите иглу для инъекций к ците с помощью тонких щипцов. Резать.

Откройте иглу на уровне, где кончик начинает изгибаться под действием инжектора. Убедитесь, что красная инъекционная смесь вытекает из иглы с увеличением в 200 раз. И с помощью ручки тонкого движения аккуратно переместите иглу для инъекций внутрь сердцевины цита.

При поверхностном введении двух растворов введенный раствор не останется внутри места УО. Если вставить слишком далеко, сайт UO будет уничтожен. Вводите от одного до трех импульсов.

Если игла достаточно тонкая, вводите с непрерывным потоком при постоянном давлении. Убедитесь, что объем инъекции соответствует от одной пятой до одной трети объема одного ооцита после инъекции. Быстро вытяните иглу, чтобы избежать протекания.

Убедитесь, что введенный раствор остается внутри клетки и что через несколько секунд введенный раствор распространяется по всему организму. Переходим к следующей в очереди ците. Оставьте несколько инъекционных эмбрионов каждой серии в качестве отрицательного контроля для оценки фоновой флуоресценции при сканировании инъекционных эмбрионов, оплодотворите ооциты сразу после инъекции серии.

Поскольку качество ооцитов со временем снижается, вводите и оплодотворяйте клетки в течение одного часа. После нереста. В зависимости от концентрации сперматозоидов добавьте от одной до пяти капель спермы в UY и перемешайте чашку.

Оболочка оплодотворения должна стать заметной на эмбрионах. Примерно через одну минуту дайте эмбрионам отсоединиться от чашки, покрытой полилизином, и введите еще одну серию ооцитов. После отделения перенесите эмбрионы в чашку Петри, покрытую аросом.

По возможности удалите эмбрионы из посуды, покрытой полилизином. До двухклеточной стадии. На стадии от двух до четырех клеток выберите успешно введенные эмбрионы с помощью флуоресцентного препарирующего эндоскопа.

При использовании фильтра DSR об успешной инъекции свидетельствует нормальная морфология, которая проявляет красный флуоресцентный сигнал, производный от фенольного красного. Храните эмбрионы и отфильтрованные SW в чашках Петри, покрытых агросом, при температуре 19 градусов Цельсия до желаемой стадии визуализации in vivo, эти репрезентативные изображения эмбрионов bronchos stoma lancia lato были сделаны после микроинъекции мРНК и покрытия флуоресцентных белков. На этом первом изображении показано, что экспрессия ядерного EGFP, полученного путем микроинъекции конструкции H two B-E-G-F-P, может быть обнаружена у эмбрионов уже на 16-й клеточной стадии.

Этот эмбрион гастро-стадии является примером повсеместной коэкспрессии ядерной вишни и мембранного EGFP. Ядерный сигнал возникает в результате микроинъекции вишневой конструкции H two BM, в то время как флуоресценция на клеточных мембранах получается путем микроинъекции коробчатой конструкции EEG FP CAAX. Оптический срез эмбриона этой гастроэнтерологической стадии показывает, как ядра и контуры клеток выделены соответственно ядерной мишенью mCherry и мембраноассоциированной EGFP.

Визуальная демонстрация этой техники микроинъекции поможет исследователям в эволюционном развитии биологического сообщества улучшить существующие и разработать новые подходы к индивидуальной визуализации, манипуляции с генами, специфичными для генов и стабильным in afi, важной модели для понимания эволюции животных.