Подготовка Mica Поддерживаемые липидного бислоя за большой размер оптической микроскопии изображений

Представленная здесь методика демонстрирует простой метод получения липидов с поддержкой MICA слоями, подходящими для визуализации с высоким разрешением, таких как исследования по отслеживанию отдельных молекул. Поверхность MICA получают путем откалывания сэндвича из одного листа MICA, приклеенного между предметным стеклом микроскопа и защитным стеклом с помощью оптического клея, который обнажает плоскую и чрезвычайно тонкую поверхность свежей слюды. При монтаже небольшой пластиковой камеры, изготовленной из полуторамиллилитрового флакона, объем липидных пузырьков, необходимых для образования бислоя, может составлять всего 30 микролитров.

В качестве первого шага возьмите многослойный лист слюды в том виде, в котором он поступает от поставщика, и разрежьте его ножницами на более мелкие кусочки. Разбейте листок на два или три более тонких листочка с помощью свежего лезвия ножа. Теперь тщательно очистите чехол для сна.

Это предполагает размещение крышки на 0,17 миллиметра. Спит в стеклянной тренировочной банке с каждой крышкой. Спите в отдельном слоте и обработайте ультразвуком в моющем средстве в течение 30 минут при температуре 60 градусов Цельсия.

Постирайте крышку. Спит от 10 до 20 раз с помощью воды с мини-ключом и сушится феном с помощью потока воздуха или азота. Возьмите предметное стекло микроскопа и очистите его на месте.

Небольшая капля около 15 микролитров низковязкой оптической кислоты на микроскоп предварительно попала в воздух и на шар. Разрежьте листок хасифа на коробке с ультрафиолетовым излучением в течение нескольких минут. С помощью скотча снимите несколько слоев слюды.

Первые несколько слоев будут фрагментированы, поэтому делайте это до тех пор, пока не увидите эти слои, прикрепленные к скотчу. Ленты бывают однородными и полными. Накройте ленту.

Нанесите каплю высоковязкого оптического клея на поверхность Micah. Убедитесь, что там нет пузырьков воздуха. Аккуратно положите чистую крышку на вредную каплю.

С помощью пинцета слегка постучите по стеклу, чтобы распределить ахе. Снова отверждайте клей с помощью ультрафиолетового излучения в течение нескольких минут. С помощью ножа расколоть бутерброд, состоящий из стекла.

Сдвиньте слюду и накройте крышкой для сна. В большинстве случаев только очень тонкий слой слюды останется приклеенным к покровному спальному месту. Используйте препарирующий микроскоп для осмотра поверхности слюды, сделав небольшую царапину кончиком иглы или пинцета.

Вы можете легко сказать, является ли поверхность на самом деле слюдой, где поверхность равномерно поцарапана, как здесь или на оптическом клее, как здесь, где поверхность светится. Возьмите стаканчик от полуторамиллилитрового стеклянного флакона, удалите газовый баллон, и приклейте колпачок к поверхности MICA с помощью лака для ногтей. Дайте ему подсохнуть в течение нескольких минут.

Теперь вы можете готовить липидный двухслойный ремонт липида за слоем, используя стандартный протокол здесь. Капля липидных пузырьков объемом 30 микролитров помещается в камеру крышки флакона и инкубируется в течение 60 минут перед промывкой буфера. После промывки образец готов к визуализации.

В этом случае он устанавливается в специально изготовленный держатель для образцов. На такой подготовленной поверхности СЛЮДЫ можно легко наблюдать одиночные молекулы. Здесь мы сравниваем A-D-O-P-C по слоям, поддерживаемым стеклом и слюдой.

Обратите внимание, что тип механизма между этими двумя поверхностями существенно отличается. Траектория отдельных молекул, прорисованная цветами на правых панелях, ясно показывает, что диффузионное поведение на MICA отличается от диффузионного поведения на стекле. Тем не менее, существенной разницы в качестве изображения нет.

Среднее переплетение прямой функции при половине максимальной интенсивности для 20 точек практически одинаково для обеих подложек, что указывает на то, что поверхность MICA полностью проницаема для света без внесения заметных оптических аберраций. В целом, MSDS демонстрирует очевидную разницу в диффузионном поведении. Однако в каждом случае можно наблюдать две популяции частиц, диффундирующих с разной скоростью.

Два различных коэффициента диффузии, быстрый и медленный, были извлечены из двойной экспоненциальной подачи в кумулятивную вероятность квадратного смещения. Для этого бислоя DOPC оба компонента диффузии быстрее на поверхности MICA, медленно движущиеся частицы на MICA примерно в 10-20 раз медленнее, чем быстрые. Однако медленное население на стекле здесь близко к тому, чтобы быть неподвижным.

Мы показали, что тип поверхности может влиять на диффузионное поведение липидных бислоев. Таким образом, нужно быть осторожным при сравнении результатов исследований на бислоях, поддерживаемых на различных подложках, таких как MICA, и стеклянных бислоев на MICA, обычно довольно сложно из-за сложной подготовки, которую мы показали, но простой, но эффективный способ подготовки таких высококачественных поверхностей.