Применение люминесцентных наночастиц по изучению ремоделирования Endo-лизосом Системе внутриклеточных бактерий

Общая цель этой процедуры заключается в изучении ремоделирования системы конечных лизосом внутриклеточными бактериями с использованием флуоресцентных наночастиц в качестве индикаторов. Это достигается путем предварительного посева пяточных клеток в предметное стекло с восемью лунками и их инкубации в течение ночи. Второй шаг – инфицирование клеток сальмонеллой и тарикой.

Затем выполняется импульсная маркировка инфицированных клеток-хозяев путем инкубации с наночастицами золота BSA Rumine. Заключительным этапом является наблюдение за изменениями эндосомальной системы клетки-хозяина с помощью конфокальной микроскопии. В конечном счете, количественная оценка внутриклеточного распределения наночастиц выполняется с помощью программного комплекса MRS.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как иммуномикроскопический, заключается в том, что n инфицированных клеток анализируются с помощью метода, который может дать представление о внутриклеточном образе жизни териков. Тем не менее, его также можно применять к другим внутриклеточным патогенам, таким как виды Gaia, Ella Prolia или микобактерии туберкулеза. Он также может быть применен к другим типам клеток-хозяев, таким как микроfeh, клеточные линии или первичные клетки.

Для синтеза 10-нанометровых наночастиц золота или NPS требуется два раствора: раствор А и раствор B.To приготовить раствор А, добавить два миллилитра 1%-ного водного хлорида золота в 160 миллилитров воды milli Q. Приготовьте раствор В, добавив восемь миллилитров 1% дигидрата тринатрия цитрата и 160 микролитров 1% дубильной кислоты в 32 миллилитра воды milli Q. Разогрейте растворы А и В до 60 градусов Цельсия, а затем перемешайте их, помешивая.

Темно-синий цвет следует наблюдать сразу примерно через 15 минут. К этому моменту раствор должен стать красного цвета. Нагрейте раствор до 95 градусов Цельсия.

Держите его при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, а затем остудите раствор до комнатной температуры. Подготовьте золотую деталь к нанесению покрытия и маркировке, добавив 900 микролитров золотого MPS в 1,5-миллилитровую пробирку эйнора и центрифугируя при 15 000 G в течение 30 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 900 микролитрах стерилизованной воды MQ.

Добавьте 100 микролитров раствора БСА и перемешайте на вихре при 800 об/мин в течение 30 минут. Удалите избыток BSA, центрифугируя препарат при 15 000 G в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте золото BSA NPS и 125 микролитров PBS.

Добавьте 12,5 микролитров одного молярного бикарбоната. Раствор эфира R domine n гидрокси CIN или NHS готовят в ДМСО непосредственно перед этим. Используйте по 15 микролитров раствора R DOMINE N-H-S-D-M-S-O на 0,5 миллилитра золотой суспензии BSA NP.

Инкубируйте реакцию в течение двух часов при комнатной температуре, перемешивая при 800 об/мин и избегая воздействия света. Затем очистите NPS рубца золота BSA с помощью диализа против PBS при четырех градусах Цельсия с пятью сменами буфера в течение периода от 36 до 48 часов после очистки, стабилизируйте NPS, добавив 10 микролитров B-S-A-P-B-S в каждый миллилитр NLS золота BSA рубина, чтобы удалить свободную или высвободившуюся центрифугу BSA Rumine при 15, 000 GS в течение 16 минут при четырех градусах Цельсия. Резус суспендирует гранулу в двух миллиграммах на миллилитр B-S-A-P-B-S после измерения оптической плотности на 520 нанометрах или наружном диаметре пять 20.

Храните золотой BSA Rod Domine NPS при температуре четыре градуса Цельсия, избегая воздействия света, клетки для этого эксперимента постоянно экспрессируют зеленый флуоресцентный белок, меченный лизосомальной гликопротеиновой лампой одним GFP и культивируются в DMEM с 10% эмбриональной сывороткой теленка при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. 000 000 на лунку в восьмилуночной камере закатывают и инкубируют в течение ночи. Бактерией для заражения клеток хела является возбудитель желудочно-кишечного тракта человека, сальмонелла и тарика. Для сравнения используются два мутантных штамма.

Все три штамма содержат плазмиду для конститутивной экспрессии усиленного GFP и культивируются в бульоне LB с соответствующими антибиотиками для поддержания плазмид для каждого штамма. Введите одну колонию бактерий в три миллилитра бульона LB с соответствующим антибиотиком и выращивайте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. В условиях встряхивания для аэрации на следующий день разведите каждую культуру от одного до 31 в свежем бульоне LB и продолжайте выращивание в течение трех с половиной часов.

Чтобы начать эту процедуру, измерьте внешний диаметр 600 бактерий субкультуры и разбавьте его до внешнего диаметра 600, равного 0,2. В один миллилитр PBS добавьте соответствующее количество бактерий к клеткам хелы в предметном стекле с 12-й камерой, чтобы достичь кратности инфекции 100. Инкубировать в течение 30 минут в клеточном инкубаторе.

Трижды промойте клетки хелы PBS, чтобы удалить неинтернализованные бактерии. Эта временная точка устанавливается как нулевой час после заражения или нулевой час пи. Добавьте в клетки 300 микролитров свежей питательной среды, содержащей 100 микрограмм гентамицина на миллилитр и выдержите в течение одного часа.

Через час. Замените среду средой для визуализации, содержащей 10 микрограммов гентамицина на миллилитр. Добавьте НПС золотого БСА рубца в клетки хела для получения конечной концентрации OD пять 20 от 0,1.

Инкубируйте в течение одного часа через час. Удалите среду и трижды промойте PBS. Наконец, добавьте 300 микролитров свежей среды для визуализации, содержащей 10% FCS и 10 микрограммов гентамицина на миллилитр.

В остальное время инкубации визуализация клеток с высоким разрешением в различных временных точках осуществляется с помощью системы конфокальной визуализации, такой как конфокальный лазерный сканирующий или вращающийся дисковый микроскоп с камерой увлажненной среды, включающей систему контроля температуры и ожидающей, пока она не стабилизируется. Оптимизируйте параметры изображения, такие как увеличение, сканирование, скорость, разрешение и размер шага Z. Используйте соответствующие настройки излучения возбуждения для GFP и золотого BSA рубичного NPS в указанные моменты времени после заражения.

Установите предметное стекло с 12 камерами А с инфицированными клетками на предметный столик микроскопа и запишите изображения для анализа изображений и изучения ремоделирования эндосомальной системы внутриклеточными сальмонеллами. Используйте программное обеспечение для анализа изображений. Откройте данные, нажав кнопку «Открыть» и выбрав файл на панели инструментов объектов в представлении «За пределы».

Нажмите на иконку, чтобы добавить новый элемент поверхности. Чтобы проанализировать интересующий регион или ROI, выберите сегмент только интересующего региона, а затем нажмите кнопку «Далее» в качестве исходного канала. Выберите третий канал.

Отметьте галочкой опцию сглаживания, чтобы настроить сглаживание полученной области. Определите значение вручную или примите автоматически сгенерированное значение. Для порога.

Выберите параметр абсолютной интенсивности для регулировки порога. Выберите ручной вариант и установите значение в области просмотра. Предварительный просмотр порогового значения поверхности отображается серым цветом.

Нажмите далее на вкладку Классифицирует поверхности. Полученную поверхность можно отфильтровать по различным критериям. Фильтр по умолчанию - это количество V-образных отверстий больше 10, другие фильтры также могут быть включены нажатием кнопки "Добавить".

В этом примере для завершения создания поверхности используется фильтр по умолчанию. Нажмите на кнопку «Готово» в списке объектов. Снимите флажок для объема товара.

Теперь в области просмотра отображается новая созданная поверхность. Красным цветом экспортируйте статистику в файл Excel, нажав кнопку «Сохранить». Золотые NPS, синтезированные по этому протоколу, имели квазисферическую форму и размер около 10 нанометров.

Покрытие BSA и мечение rho domine не влияли на их морфологию или размер. Изучить ремоделирование клеточной эндосомальной системы хозяина внутриклеточными сальмонеллами. Клетки Hela были фиктивно инфицированы или заражены сальмонеллой дикого типа или двумя мутантными штаммами и пульсом, преследуемым 10-нанометровым золотом.

BSA rod domine n горох в неинфицированных клетках, NPS равномерно распределены в поздних эндосомах или лизосомах. Напротив, NPS в клетках, инфицированных сальмонеллой дикого типа, был в значительной степени перестроен через восемь часов после заражения. Была сформирована стабилизированная сеть индуцированных сальмонеллой нитей или просеивающих веществ, и большинство МП было обнаружено в пределах трубчатых структур.

Мутантные штаммы продемонстрировали различное поведение через восемь часов после заражения. Мутантный штамм SSAV был заключен внутри сальмонеллы, содержащей VAE или SCV. Несмотря на то, что просеиваемые вещества не образовывались, большинство МП все еще располагались в свободных поздних эндосомах или лизосомах для СИФ.

Произошел побег мутантного штамма сальмонеллы в цитоплазму, и никакой связи между NPS и бактериями не наблюдалось. Когда была изучена доступность конечной лизосомальной системы на различных фазах сальмонеллезной инфекции, результаты показали, что во всех случаях большая часть интернализованных НПВ накапливалась в СКВ или СИФ. Могут быть выполнены и другие методы, трансмиссионные микроскопические методы шеи.

Это может ответить на дополнительные вопросы, такие как ультраструктура или мембранные компартменты в некоторых наноинфицированных клетках-хозяевах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить флуоресцентные наночастицы. Они могут быть использованы для маркировки хостеров, модифицированных внутриклеточными сальмонеллами.