Определение концентрации вируса через бляшки Анализы: используя традиционные и новейшие системы Наложение

Общая цель этой процедуры заключается в определении концентрации вируса путем количественной оценки инфекционного варьона путем подсчета дискретных бляшек в клеточной культуре. Это достигается путем первичной гальванизации клеток с образованием сливающегося монослоя для инфекции. Вторым шагом является последовательное разведение неизвестного вирусного образца, подлежащего количественному определению.

Далее конфлюентные монослои заражаются с помощью последовательного разведения вирусного запаса с последующим наложением иммобилизующего слоя. Последним шагом является фиксация и окрашивание бляшек после соответствующего времени инкубации рассматриваемого вируса, чтобы подсчитать незаметные бляшки. В конечном счете, анализ бляшек может быть использован и модифицирован различными способами для определения титров вируса в неизвестном вирусном образце.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как полутвердое покрытие, заключается в том, что нанесение и удаление намного проще как при высокопроизводительном, так и при традиционном применении. Кроме того, не требуется нагревание реагентов. Применение этого метода распространяется на исследование многих различных литических вирусов в виде использования жидкого слоя.

Формат 96 лунок позволяет проводить быстрый скрининг новых терапевтических соединений, что может значительно сократить долгие часы, проведенные в лаборатории при проведении традиционных анализов бляшек. Исходные растворы также могут быть приготовлены за день до первого анализа для приготовления фиксирующего раствора 10% формальдегида в дистиллированной воде путем смешивания 5,56 миллилитров 36% стандартного формальдегида с 14,44 миллилитрами дистиллированной воды. Затем приготовьте кристаллический фиолетовый краситель, состоящий из 1% кристаллической фиалки в 20% этанола, разведенного дистиллированной водой.

Затем, работая в стерильных условиях, приготовьте две среды для бляшки для соответствующего типа используемых клеток. Отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 мкм, если какой-либо из реагентов не стерилен. Приготовить жидкую накладку для использования в бляшке из расчета по 2,4 г ави ячейку в колбу, содержащую 97,6 миллилитров дистиллированной воды, которую быстро перемешивают с помощью мешалки.

Перемешайте раствор при комнатной температуре, пока он не станет слишком вязким для перемешивания. На этом этапе переложите колбу в шейкер для колб и сильно перемешайте в течение 30 минут, чтобы обеспечить равномерную гомогенизацию. Наконец, автоклавируйте раствор при температуре 121 градус Цельсия при 14 фунтах на квадратный дюйм в течение 30 минут.

А когда программа будет завершена, хранить в запечатанном виде при комнатной температуре для наложения на арос. Приготовьте 0,6%-ный раствор агро в дистиллированной воде. Перемешайте с помощью мешалки и автоклава доведите до раствора или наложения карбоксиметилцеллюлозы.

Приготовьте 2%-ный раствор карбоксиметилцеллюлозы в дистиллированной воде и перемешайте в автоклаве на следующий день после нанесения покрытия. Используйте перевернутый микроскоп, чтобы проверить беглость и жизнеспособность клеток до начала анализа. Убедитесь, что клетки демонстрируют стандартную клеточную морфологию и примерно 90% беглости со.

Выполните десятикратное последовательное разведение инфицированных образцов в клеточных питательных средах, варьируя количество необходимых разведений в зависимости от ожидаемого титра рассматриваемого вируса. Кроме того, подготовьте неинфицированный контрольный образец, чтобы самостоятельно обеспечить жизнеспособность клеток и помочь в идентификации бляшек. Пипеткой неинфицированный контроль и серийное разведение следует проводить в лунки планшета, стараясь не допустить нарушения монослоя.

Используйте достаточный объем посевного материала, чтобы покрыть клетки, сохраняя при этом объем как можно меньше, чтобы максимизировать контакт вируса с монослоем. Поместите планшеты в инкубатор для тканевых культур и заражайте клетки в течение от 45 минут до одного часа каждые 20 минут. Аккуратно покачивайте пластины, чтобы обеспечить равномерное покрытие и предотвратить высыхание клеточного монослоя во время инфекции.

Приготовьте рабочий раствор накладки для жидких накладок. Смешайте нагретый материал для налета и от 1,2 до 2,4% при комнатной температуре Составьте авитическую клетку в соотношении один к одному, чтобы получить рабочий раствор от 0,6 до 1,2% накладки на ячеечную среду или AROS или CMC для смешанной теплой среды для налета, и стоковый раствор либо с 0,6% AROS, либо с 2% CMC в соотношении один к одному. Затем поместите на водяную баню с температурой 56 градусов Цельсия, на 30 минут для выравнивания температуры.

Убедитесь, что раствор теплый, но не горячий на ощупь, чтобы предотвратить гибель клеток и снизить титры вируса. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение от двух до 14 дней в зависимости от анализируемого вируса, чтобы зафиксировать клетки с помощью жидкого слоя, слейте или отаскайте покрытие Е-клеток, затем нанесите пипетку 10% раствора формальдегида в лунки и зафиксируйте при комнатной температуре на 30 минут на ночь или непосредственно AROS или CMC. Добавьте раствор формальдегида в накладку на один час до ночи при комнатной температуре после фиксации, выбросьте формальдегид, а затем вручную удалите шпателем полутвердые пробки в местах скопления.

Промойте налеты aby cell водой, чтобы удалить остатки фиксатора наложения перед окрашиванием. Для окрашивания покройте клетки минимальным количеством кристаллического фиолетового раствора примерно на 15 минут. При необходимости раскачивайте пластины, чтобы обеспечить равномерное покрытие.

Аккуратно смойте хрустальное фиолетовое пятно водой, после того как оно закрепится, испачкается и высохнет, храните плекс на неопределенный срок для будущего анализа. Подсчитайте бляшки в каждой скважине, не считая скважин с менее чем пятью или более 100 бляшек. Возьмите среднее значение для любых технических тиражей того же разбавления.

Обратите внимание на размер и морфологию зубного налета. Определите титр вируса в стоковой пробе, взяв среднее количество бляшек для разведения и обратное общему коэффициенту разведения. На этом изображении показано сравнение наложения бляшек вируса лихорадки Рифт-Валли с использованием 12-луночных планшетов: бюро были покрыты в 2,5 раза по 10 пятых клеток в 12-луночных планшетах и заражены 200 микролитрами с использованием того же серийно разведенного исходного образца MP 12.

После заражения наносили 1,5 миллилитровые накладки 0,3% арос, 0,6% AVY или 1% CMC для непосредственного сравнения наслоений. На этой гистограмме показаны результаты подсчета бляшек и титрирования для всех трех наложений. Здесь. Сравнение наложения бляшек ViiV с использованием 12-луночных планшетов показало, что бюро были покрыты, как и раньше, и инфицированы объемом 200 микролитров с использованием того же серийно разведенного стартового образца вакцинного штамма ViiV TC 83 после заражения, 1,5 мл наслоений 0,3%aros, 0,6% avy cell или 1% CMC, как и раньше.

Опять же, гистограмма показывает результаты подсчета бляшек и титрования для всех трех наложений. На этом рисунке показан пример наложения налета с высокой пропускной способностью. 96-луночный планшет с ВИР, покрытый в трех случаях по 10 четвертых клеток на лунку, был заражен 50 микролитрами инокулюма с использованием одного и того же серийно разведенного исходного образца вируса лихорадки Рифт-Валли MP 12 в течение одного часа в четырехкратном дубликате для наложений 0,6 и 1,2%. Окончательные концентрации ави-клеток были испытаны с целью определения целесообразности и воспроизводимости использования жидких наслоений с высокой пропускной способностью.

На этой гистограмме показаны титры, определенные из каждого наложения. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что каждый вирус уникален, и может потребоваться оптимизация, включая использование различных типов клеток, времени инкубации и/или питательной среды. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять базовый анализ бляшек с использованием как жидких, так и полутвердых наслоений.