Визуализация Номера для литическую экзоцитоза Cryptococcus neoformans От макрофагов с помощью цифровых световой микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации нелитического экзоцитоза Cryptococcus neoformans из макрофагов первичных нейронов костного мозга. Это достигается путем предварительного осаждения и инфицирования активированных нейромакрофагов грибковыми клетками, чтобы обеспечить фагоцитоз и интернализацию ксеомина. Вторым шагом является удаление внеклеточных грибковых клеток для обеспечения прозрачного монослоя инфицированных и неинфицированных макрофагов.

Затем макрофаги инкубируются в камере с контролируемой температурой углекислого газа и регистрируются в течение 24 часов для того, чтобы зафиксировать случаи нелитического экзоцитоза и других взаимодействий. Последним шагом является создание фильма путем сжатия всех кадров, сделанных в течение 24 часов. В конечном счете, визуализация макрофагов с помощью цифровой световой микроскопии используется для наблюдения за разнообразием типов нелитического экзоцитоза, которым подвергаются макрофаги в течение 24 часов инфекции.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия патогена хозяина, такие как время и количественная оценка клеточных событий За день до эксперимента выберите одну отдельную колонию старшего мастера, которая была выращена на пластине из агара сбарро, и привьте. 10 миллилитров бульона сбарро. Дайте культуре вырасти в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию, встряхивая со скоростью 250 об/мин после эвтаназии мышей, как описано в письменном протоколе.

Простерилизуйте весь корпус 70%-ным этиловым спиртом. Удалите бедренные кости и большеберцовую кость и поместите кости в стерильный дуэт, модифицированный орлиный медиум или DMEM. Затем удалите лишние ткани и мышцы с помощью деликатных салфеток до тех пор, пока кости не станут полностью чистыми.

Поместите только неповрежденные кости в чашку Петри, содержащую 70% этилового спирта, и инкубируйте в течение трех минут, чтобы убить ассоциированные микроорганизмы. Удалите косточки и поместите в чашку Петри со стерильным ДМЭМ. Далее аккуратно срежьте концы костей.

Держите кость над конической трубкой MT 50 миллилитров, помещенной на лед, и с помощью иглы 25 калибра осторожно промывайте 10 миллилитров холодного DMEM через каждую кость. Затем центрифугируйте собранную клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 10 минут при 650-кратном перегрузке. Во время этого центрифугирования приготовьте и отфильтруйте стерилизованную питательную среду для макрофагов костного мозга, как описано в текстовом протоколе. Далее ресуспендируйте полученную палитру с 10 миллилитрами подающей среды.

Пропустите клеточную суспензию через клеточный фильтр с плотностью 70 микрометров, чтобы разрушить клеточные комки и удалить крупный мусор. Затем в тарелки помещают один миллилитр суспензии клеток штамма в 10 миллилитров питательной среды, чашки Петри, которые предназначены для использования в культуре тканей. Дайте клеткам прилипнуть при температуре 37 градусов Цельсия с 10% углекислым газом в течение семи дней.

Смена подаваемой среды, как описано в текстовом протоколе за день до эксперимента. Отделите макрофаги от планшета, удалив питательную среду, и добавьте пять миллилитров щадящего реагента для удаления клеток в планшет после инкубации клеток в течение 5-10 минут. При температуре 37 градусов Цельсия удалите макрофаги с помощью щадящего пипетирования.

Гранулируйте ячейки центрифугированием при 650-кратном перегрузке в течение 10 минут перед повторным сгибанием гранулы в одном миллилитре питательной среды. Используя разведение один к 20, рассчитайте концентрацию макрофагов, пипетируя 10 микролитров клеточной суспензии в гемоцитометр с использованием 14-миллиметрового стекла с дном. Чашки Петри помещают концентрацию от 10 до 10 до пятой части макрофагов непосредственно во внутреннюю лунку, которая вмещает максимум 200 микролитров.

Следите за тем, чтобы не превысить этот объем. Дайте клеткам прилипнуть к стеклянной чашке Петри, поместив чашки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на один час. Затем добавьте один-два миллилитра питательной среды, дополненной липополисахаридом из расчета один миллиграмм на миллилитр и интерфероном гамма.

При концентрации 500 единиц на миллилитр дайте клеткам инкубироваться в течение ночи в день эксперимента. Извлеките один миллилитр из посева G-клеток, интродуцированной в течение ночи, и прикалывайте дрожжевые клетки центрифугированием в течение пяти минут 420 раз G.To удалите среду и внеклеточные продукты криптококковой инфекции, трижды промойте клетки фосфатно-солевым буфером или PBS с последующим центрифугированием, как раньше. После резуса суспендируют дрожжевую клеточную гранулу в одном миллилитре стерильной PBS и делают пипетку разведения 1 к 100, вводят 10 микролитров разведения в гемоцитометр и подсчитывают клетки.

Рассчитайте концентрацию дрожжевых клеток, необходимую для кратности инфекции от одного до пяти. Расчетный объем суспензии криптококковых клеток добавить к одному миллилитру питательной среды с моноклональным антителом, 18 В семи в концентрации 10 мкг на миллилитр. Инкубируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение пяти минут.

Далее извлеките питательную среду из стеклянной чашки Петри и промойте макрофаги один раз стерильным PBS. Затем добавьте 100 микролитров opsonize cmin прямо в лунку, после чего следует инкубация с дрожжами в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 10% углекислом газе. После совместной инкубации с помощью микроскопа следует, что макрофаги интернализовали c eForms, чтобы считаться интернализованными криптококковыми клетками, должны быть четко видны в пределах макрофага, как указано большим наконечником стрелки.

Меньший наконечник стрелки указывает на неинфицированный макрофаг без грибковых клеток. Вымойте чашку Петри три раза стерильным PBS, чтобы удалить все внеклеточные c-неоформы. Затем добавьте от одного до двух миллилитров питательной среды без моноклонального антитела для проведения этих экспериментов.

Перед началом эксперимента требуется микроскоп, оснащенный прилагаемой инкубационной камерой, которая включает в себя подачу углекислого газа, и нагревательным блоком. Прогрейте инкубационную камеру не менее 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Убедитесь, что в начале эксперимента единица углекислого газа показывает 5%.

Поместите чашку Петри со стеклянным дном на крышку платформы микроскопа с зажженным углекислым газом и закройте все дверцы, чтобы предотвратить утечку тепла с помощью объектива 10 раз с микроскопом в фазовом контрасте, сосредоточьтесь на чистом поле инфицированных макрофагов, настройте программное обеспечение микроскопа на получение изображения каждые четыре минуты в течение 24 часов. Через 24 часа эксперимент будет завершен, и в общей сложности будет собрано 361 изображение. Экспортируйте эти изображения в формате JPEG со сжатием 5%.

Используя программное обеспечение для работы с изображениями J, просматривайте изображения в виде визуального стека со скоростью пять кадров в секунду. В первом кадре фильма показано множество макрофагов по всему полю, некоторые из которых не инфицированы, а некоторые имеют различное количество криптококковых клеток. По мере развития фильма, все клетки находятся в движении, и в этом фильме можно увидеть, как они перемещаются по полю, становится ясно, что криптококковые клетки находятся в пределах инфицированного макрофага.

Макрофаг начинает возбуждаться, и можно увидеть дрожжевую клетку, но в зоне FGA криптококковые клетки быстро выводятся в окружающую среду. Второй инфицированный макрофаг подвергается нелитическому экзоцитозу, и большее количество дрожжевых клеток высвобождается во внеклеточное пространство. Клетки-хозяева остаются жизнеспособными после криптококкового экзоцитоза, о чем свидетельствует их способность продолжать движение.

Иногда макрофаги взаимодействуют таким образом, что это облегчает перенос криптококковых клеток между клетками-хозяевами. Дрожжевые клетки не подвергаются воздействию внеклеточной среды, и клетки-хозяева остаются жизнеспособными. В этом фильме два инфицированных макрофага дважды создают межклеточные мосты для переноса криптококковых клеток от одного макрофага к другому.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как использовать цифровую световую микроскопию для визуализации макрофагов, подвергающихся нелитическому экзоцитозу, и других взаимодействий патогенов хозяина.