Физиологические Записи и РНК Секвенирование Вкусовые придатков Желто-лихорадки комаров Комар желтолихорадочный
30 декабря 2014 г.
Использование двух методов оценки экспрессии генов в крупных вкусовых придатков Комар желтолихорадочный, мы определили набор генов, предположительно, лежащих в основе нейронных ответов на горьких и отталкивания соединений, а определяется электрофизиологического исследования.
Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за реакцией вкусовых нейронов у насекомых и в измерении экспрессии генов во вкусовых тканях. Это достигается путем предварительной записи реакции конкретных вкусовых волосков на несколько вкусов в разных концентрациях. Вторым этапом является тщательное рассечение вкусовых тканей.
Затем отделите образцы по полу и придатку. Затем выделите общую РНК из каждого образца ткани и создайте препараты CD NA для секвенирования нового поколения и QPCR. Последним шагом является анализ данных об экспрессии генов и формирование гипотез, например, о том, как экспрессированные сенсорные гены хемоса опосредуют физиологические реакции на вкусы у насекомых.
В конечном счете, электрофизиологические записи используются для отображения рецептивного диапазона вкусовой системы насекомых, а секвенирование РНК вкусовой ткани используется для выделения наиболее важных генетических компонентов вкусовой рецепции. Как правило, люди, плохо знакомые с этими методами, будут испытывать трудности из-за небольшого размера химиотерапии насекомых. Сенсорные придатки.
Будь то вскрытие или запись из мелких органов насекомых у пациентов являются ключом к освоению этих техник. Чтобы начать эту процедуру, потяните за тонким наконечником записывающий электрод в пипетке-пуллере со стеклянным капилляром под препарирующий микроскоп. Осторожно отломайте наконечник электрода так, чтобы его отверстие было достаточно широким, чтобы обернуть целевой центум, но достаточно маленьким, чтобы избежать контакта с соседними структурами.
Затем обезболите двух-четырех взрослых насекомых в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия на 20 секунд. После этого обездвижите одного из насекомых с помощью покровного листка с небольшими полосками целлофановой ленты. Под микроскопом.
Определите датчики цели по их морфологии и положению и сориентируйте животное так, чтобы обеспечить свободный доступ к нему под углом входа электрода. Затем вставьте вольфрамовую проволоку в его спинную грудную клетку. Чтобы он служил заземляющим электродом, заполните стеклянный электрод с наконечника интересующим вас стимулирующим раствором.
Вытряхните пузырьки воздуха, удерживая кончик нажатым. Вставьте в электрод серебряную проволоку, которая будет служить записывающим и стимулирующим электродом. После этого подключите электроды к предусилителю, что позволяет сократить время установления для захвата нейронной активности.
Предварительный усилитель подключается к компьютеру, оснащенному программным обеспечением для записи скачков напряжения для сбора, хранения и анализа электрических сигналов. Теперь стимулируйте центум с помощью решения для управления, чтобы обеспечить его функциональность. Подсчитайте всплески, начиная с 200 миллисекунд после артефакта стимула.
Для получения результатов дозового ответа. Подвергайте центум воздействию возрастающих концентраций экспериментального химического вещества и делайте интервалы между стимуляциями не менее трех минут, чтобы обеспечить адекватное восстановление. В этой процедуре готовят неглубокий охладитель с сухим льдом.
Для пробирок для сбора тканей пометьте пробирки с защелкивающимися крышками объемом 1,5 миллилитра, не содержащими РНК, для сбора различных типов ткани. Держите трубки закрытыми, чтобы избежать чрезмерной конденсации. Затем обезболите от 30 до 40 комаров в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия на 15-30 секунд.
Затем перенесите обезболенных комаров в холодную стадию и отсортируйте по половому признаку. Переверните насекомых спинной стороной вниз, взявшись за их крылья, стараясь не повредить вкусовые придатки. Под препарирующим микроскопом отделите парную метку Bella или лапки у самцов или самок, осторожно захватывая комара pro Bois прямо рядом с меткой.
Белла с помощью одной пары щипцов обнажит внутренний стилус и удалите метку с помощью другой пары щипцов. Затем поместите ткань в холодную трубку для сбора тарзальной ткани. Аккуратно возьмитесь за лапку комара в месте соединения большеберцовой кости и первого сегмента предплюсны, и удалите лапки.
Затем поместите салфетку в холодную пробирку с маркировкой. Вращайте пробирки для сбора в течение одной минуты в центрифуге с нулевым температурой Цельсия под давлением силы тяжести в 9 000 раз, чтобы ткань оставалась на дне пробирки. Если во время рассечения в пробирках для сбора скапливается влага, добавьте 50 микролитров холодного реагента триол для покрытия и защиты собранной ткани.
Заморозьте пробирки в штативе для пробирок объемом 1,5 миллилитра, содержащем жидкий азот. После этого приготовьте плотно прилегающие пестики без РНК, охладив их на сухом льду до разрушения тканей. Затем измельчите ткань в мелкий порошок и повторите еще раз.
Доведите общий объем триола до одного миллилитра и восстановите. Подвешивайте подземную ткань с помощью вортекса. После этого добавьте в измельченную ткань 200 микролитров хлороформа и тщательно перемешайте.
Через пять минут при комнатной температуре раскрутите его в центрифуге при температуре 4 градуса Цельсия при 11 000 силе тяжести в течение 15 минут. Осторожно добавьте водный слой непосредственно в колонку с фильтром геномной ДНК. Затем раскрутите его в 11 000 раз сильнее силы тяжести в течение пяти минут.
Добавьте равный объем РНК без 70% этанола в проточный поток и перемешайте с помощью пипетирования. Перенесите жидкость в колонку для сбора РНК и продолжайте экстракцию РНК. После этого количественно определите и оцените чистоту общей РНК на прецизионном спектрофотометре и приступайте к использованию любого стандартного метода секвенирования РНК.
Следовые записи потенциалов действия от вкусовой стимуляции E GTI помощника демонстрируют эффективность прямой стимуляции рядом химических веществ. Этот метод может быть использован для количественной оценки реакции на любое стимулирующее химическое вещество путем подсчета пиков заданной амплитуды и длительности в разумном временном диапазоне, составляющем менее 500 миллисекунд. Эти три шипа соответствуют трем подтипам сенсорных нейронов с разной чувствительностью.
Биологические репликации для наборов данных RNA-Seq могут быть ограничены стоимостью или сложностью сбора тканей. Q-R-T-P-C-R предлагает возможность валидации небольших подмножеств общей экспрессии генов с меньшими затратами и меньшим количеством источников. РНК, показанная на левой панели рядом друг с другом, представляет собой сравнение относительной экспрессии, определенной с помощью RN Aeq, и относительной экспрессии, определенной с помощью Q-R-T-P-C-R.
Эти два метода основаны на разных химических составах для оценки численности генов. Функции статистической эквивалентности, отображаемые графически на правой панели, демонстрируют пределы достоверности в каждом случае. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как препарировать ткани насекомых для выделения РНК и записывать нейронные сигналы от вкусовых волосков живых насекомых.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучаются ответы вкусовых нейронов Aedes aegypti на различные вкусы и измеряется экспрессия генов во вкусовых тканях. С помощью электрофизиологических методов в ходе исследования определяются гены, связанные с нейронными ответами на горькие и репеллентные соединения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Энтомология
- Экспрессия генов
Теоретические сведения
- Вкусовая система насекомых играет ключевую роль в восприятии вкуса.
- Aedes aegypti служит модельным организмом для изучения сенсорных реакций.
- Понимание экспрессии генов может раскрыть механизмы вкусового восприятия.
- Электрофизиологические методы необходимы для измерения нейронной активности.
Цель исследования
- Наблюдение за реакциями вкусовых нейронов на различные вкусовые соединения.
- Измерение экспрессии генов во вкусовых тканях Aedes aegypti.
- Формулирование гипотез о том, как хемосенсорные гены влияют на физиологические реакции на вкусы.
Используемые методы
- Регистрация ответов вкусовых волосков на различные вкусовые стимулы в разных концентрациях.
- Препарирование вкусовых тканей и разделение образцов по полу и типу придатка.
- Выделение тотальной РНК из каждого образца ткани.
- Приготовление кДНК для секвенирования следующего поколения (NGS) и количественной ПЦР (qPCR).
Основные результаты
- Идентификация генов, связанных с нейрональными ответами на горькие соединения.
- Представление о генетической основе вкусового восприятия у Aedes aegypti.
- Анализ данных подтверждает гипотезы относительно функций хемосенсорных генов.
- Электрофизиологические результаты коррелируют с данными об экспрессии генов.
Выводы
- Данное исследование углубляет понимание функций вкусовых нейронов у насекомых.
- Полученные результаты расширяют общие знания в области сенсорной биологии.
- Будущие исследования могут быть направлены на изучение возможностей применения этих данных в стратегиях борьбы с вредителями.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Понимание молекулярных основ хемосенсорного восприятия у переносчиков заболеваний, таких как Aedes aegypti, позволяет проводить валидацию мишеней для разработки новых репеллентов. Электрофизиологическое и транскриптомное профилирование вкусовых тканей обеспечивает механическое снижение рисков, связывая экспрессию генов с поведенческими реакциями, такими как нарушение поиска хозяина. Этот комплексный подход повышает прогностическую точность при скрининге соединений, воздействующих на сенсорные пути комаров, что служит основой для разработки стратегий борьбы с переносчиками на ранних этапах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет идентифицировать вкусовые рецепторные нейроны, реагирующие на ДЭТА и хинин, что дает возможность исследовать пути восприятия горького вкуса у переносчиков заболеваний.
- Практическая ценность: Обеспечивает валидированный физиологический показатель для скрининга соединений, модулирующих хемосенсорные нейроны комаров.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Секвенирование РНК тканей лабеллума и тарзусов позволяет выявить профили экспрессии генов хеморецепции, что способствует разработке анализов, согласованных с биомаркерами.
- Практическая ценность: Валидация методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR) обеспечивает воспроизводимость и количественную точность при межплатформенном сравнении экспрессии генов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Устанавливает связь между экспрессией хемосенсорных генов и восприятием репеллентов, что позволяет проводить скрининг на основе конкретных мишеней для нарушения поведения насекомых при поиске хозяина.
- Практическая ценность: Специфический отбор тканей (тарзусы про-, мезо- и метаторакса) обеспечивает возможность создания масштабируемых моделей скрининга с разделением по полу.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод связывает ранний поиск мишеней с помощью фенотипического скрининга с доклинической валидацией путем установления связи между нейронной активностью и молекулярными мишенями в хемосенсорных тканях.
- Биология открытий: Электрофизиологические записи позволяют проверить гипотезы о влиянии соединений на частоту разрядов и чувствительность вкусовых нейронов.
- Скрининг: Данные RNA-seq и qRT-PCR обеспечивают стандартизированные количественные показатели экспрессии генов для оценки взаимодействия с мишенью.
- Аналитика: Подсчет спайков и статистическая проверка эквивалентности позволяют сравнивать нейронные ответы и экспрессию генов при различных условиях и методах.
- Трансляционные исследования: Валидация хемосенсорных генов способствует согласованию биомаркеров для прогнозирования эффективности репеллентов in vivo.
- Корпоративное повторное использование: Комбинированный рабочий процесс «электрофизиология — транскриптомика» может быть применен для различных видов насекомых и библиотек химических соединений с целью снижения рисков при поиске мишеней для контроля переносчиков.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Механистическое снижение рисков при выборе мишеней репеллентов путем прямой корреляции нейронной активности и экспрессии генов.
- Практическая ценность: Стандартизированные протоколы препарирования тканей, выделения РНК и электрофизиологии обеспечивают воспроизводимость результатов в разных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Позволяет на ранних этапах принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки кандидатов в репелленты путем подтверждения взаимодействия с мишенями в соответствующих хемосенсорных тканях.
- Влияние на портфель разработок: Обеспечивает приоритезацию соединений с учетом рисков, которые модулируют специфические пути вкусовых рецепторов, связанных с поведением по поиску хозяина.
Особенности реализации
- Для получения надежных записей с вкусовых волосков требуется опыт в области электрофизиологии насекомых и препарирования тканей под микроскопом.
- Для высококачественного выделения РНК из небольших образцов тканей необходим доступ к оборудованию, свободному от РНКаз, центрифугам и спектрофотометру.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует единообразного определения пола особей, отделения придатков и соблюдения холодовой цепи для предотвращения деградации РНК.
- Адаптация метода для других видов комаров или тканей может потребовать оптимизации расположения электродов и техники препарирования из-за морфологических различий.
- Ограничение количества биологических повторов при RNA-seq из-за дефицита тканей может быть компенсировано подтверждением основных мишеней с помощью qRT-PCR, как показано в данном исследовании.
