Физиологические Записи и РНК Секвенирование Вкусовые придатков Желто-лихорадки комаров Комар желтолихорадочный

Использование двух методов оценки экспрессии генов в крупных вкусовых придатков Комар желтолихорадочный, мы определили набор генов, предположительно, лежащих в основе нейронных ответов на горьких и отталкивания соединений, а определяется электрофизиологического исследования.

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за реакцией вкусовых нейронов у насекомых и в измерении экспрессии генов во вкусовых тканях. Это достигается путем предварительной записи реакции конкретных вкусовых волосков на несколько вкусов в разных концентрациях. Вторым этапом является тщательное рассечение вкусовых тканей.

Затем отделите образцы по полу и придатку. Затем выделите общую РНК из каждого образца ткани и создайте препараты CD NA для секвенирования нового поколения и QPCR. Последним шагом является анализ данных об экспрессии генов и формирование гипотез, например, о том, как экспрессированные сенсорные гены хемоса опосредуют физиологические реакции на вкусы у насекомых.

В конечном счете, электрофизиологические записи используются для отображения рецептивного диапазона вкусовой системы насекомых, а секвенирование РНК вкусовой ткани используется для выделения наиболее важных генетических компонентов вкусовой рецепции. Как правило, люди, плохо знакомые с этими методами, будут испытывать трудности из-за небольшого размера химиотерапии насекомых. Сенсорные придатки.

Будь то вскрытие или запись из мелких органов насекомых у пациентов являются ключом к освоению этих техник. Чтобы начать эту процедуру, потяните за тонким наконечником записывающий электрод в пипетке-пуллере со стеклянным капилляром под препарирующий микроскоп. Осторожно отломайте наконечник электрода так, чтобы его отверстие было достаточно широким, чтобы обернуть целевой центум, но достаточно маленьким, чтобы избежать контакта с соседними структурами.

Затем обезболите двух-четырех взрослых насекомых в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия на 20 секунд. После этого обездвижите одного из насекомых с помощью покровного листка с небольшими полосками целлофановой ленты. Под микроскопом.

Определите датчики цели по их морфологии и положению и сориентируйте животное так, чтобы обеспечить свободный доступ к нему под углом входа электрода. Затем вставьте вольфрамовую проволоку в его спинную грудную клетку. Чтобы он служил заземляющим электродом, заполните стеклянный электрод с наконечника интересующим вас стимулирующим раствором.

Вытряхните пузырьки воздуха, удерживая кончик нажатым. Вставьте в электрод серебряную проволоку, которая будет служить записывающим и стимулирующим электродом. После этого подключите электроды к предусилителю, что позволяет сократить время установления для захвата нейронной активности.

Предварительный усилитель подключается к компьютеру, оснащенному программным обеспечением для записи скачков напряжения для сбора, хранения и анализа электрических сигналов. Теперь стимулируйте центум с помощью решения для управления, чтобы обеспечить его функциональность. Подсчитайте всплески, начиная с 200 миллисекунд после артефакта стимула.

Для получения результатов дозового ответа. Подвергайте центум воздействию возрастающих концентраций экспериментального химического вещества и делайте интервалы между стимуляциями не менее трех минут, чтобы обеспечить адекватное восстановление. В этой процедуре готовят неглубокий охладитель с сухим льдом.

Для пробирок для сбора тканей пометьте пробирки с защелкивающимися крышками объемом 1,5 миллилитра, не содержащими РНК, для сбора различных типов ткани. Держите трубки закрытыми, чтобы избежать чрезмерной конденсации. Затем обезболите от 30 до 40 комаров в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия на 15-30 секунд.

Затем перенесите обезболенных комаров в холодную стадию и отсортируйте по половому признаку. Переверните насекомых спинной стороной вниз, взявшись за их крылья, стараясь не повредить вкусовые придатки. Под препарирующим микроскопом отделите парную метку Bella или лапки у самцов или самок, осторожно захватывая комара pro Bois прямо рядом с меткой.

Белла с помощью одной пары щипцов обнажит внутренний стилус и удалите метку с помощью другой пары щипцов. Затем поместите ткань в холодную трубку для сбора тарзальной ткани. Аккуратно возьмитесь за лапку комара в месте соединения большеберцовой кости и первого сегмента предплюсны, и удалите лапки.

Затем поместите салфетку в холодную пробирку с маркировкой. Вращайте пробирки для сбора в течение одной минуты в центрифуге с нулевым температурой Цельсия под давлением силы тяжести в 9 000 раз, чтобы ткань оставалась на дне пробирки. Если во время рассечения в пробирках для сбора скапливается влага, добавьте 50 микролитров холодного реагента триол для покрытия и защиты собранной ткани.

Заморозьте пробирки в штативе для пробирок объемом 1,5 миллилитра, содержащем жидкий азот. После этого приготовьте плотно прилегающие пестики без РНК, охладив их на сухом льду до разрушения тканей. Затем измельчите ткань в мелкий порошок и повторите еще раз.

Доведите общий объем триола до одного миллилитра и восстановите. Подвешивайте подземную ткань с помощью вортекса. После этого добавьте в измельченную ткань 200 микролитров хлороформа и тщательно перемешайте.

Через пять минут при комнатной температуре раскрутите его в центрифуге при температуре 4 градуса Цельсия при 11 000 силе тяжести в течение 15 минут. Осторожно добавьте водный слой непосредственно в колонку с фильтром геномной ДНК. Затем раскрутите его в 11 000 раз сильнее силы тяжести в течение пяти минут.

Добавьте равный объем РНК без 70% этанола в проточный поток и перемешайте с помощью пипетирования. Перенесите жидкость в колонку для сбора РНК и продолжайте экстракцию РНК. После этого количественно определите и оцените чистоту общей РНК на прецизионном спектрофотометре и приступайте к использованию любого стандартного метода секвенирования РНК.

Следовые записи потенциалов действия от вкусовой стимуляции E GTI помощника демонстрируют эффективность прямой стимуляции рядом химических веществ. Этот метод может быть использован для количественной оценки реакции на любое стимулирующее химическое вещество путем подсчета пиков заданной амплитуды и длительности в разумном временном диапазоне, составляющем менее 500 миллисекунд. Эти три шипа соответствуют трем подтипам сенсорных нейронов с разной чувствительностью.

Биологические репликации для наборов данных RNA-Seq могут быть ограничены стоимостью или сложностью сбора тканей. Q-R-T-P-C-R предлагает возможность валидации небольших подмножеств общей экспрессии генов с меньшими затратами и меньшим количеством источников. РНК, показанная на левой панели рядом друг с другом, представляет собой сравнение относительной экспрессии, определенной с помощью RN Aeq, и относительной экспрессии, определенной с помощью Q-R-T-P-C-R.

Эти два метода основаны на разных химических составах для оценки численности генов. Функции статистической эквивалентности, отображаемые графически на правой панели, демонстрируют пределы достоверности в каждом случае. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как препарировать ткани насекомых для выделения РНК и записывать нейронные сигналы от вкусовых волосков живых насекомых.