Изоляция потенцированной Hsp104 вариантов Используя дрожжи Proteinopathy Модели

Целью данного эксперимента является скрининг библиотек HS P 1 0 4 на предмет отбора вариантов, подавляющих токсичность белков, связанных с нарушениями неправильного сворачивания белков. Это достигается за счет котрансформации библиотек вариантов HSP 1, 0 4 с субстратом, ассоциированным с заболеванием, в дрожжах и coex, экспрессирующих два белка в качестве второго этапа. Отобранные дрожжи обрабатывают пятью фторкислотами или пятью FOA для противодействия отбору плазмиды HSP 1004.

Затем попадания секвенируют путем амплификации мутагенного участка с помощью ПЦР колонии или идентификации мутаций в гене HSP 1 0 4. В конечном счете, подавление токсичности ассоциированного с заболеванием субстрата может быть оценено для выявления вариантов HS P 1 0 4, которые являются наиболее перспективными для дальнейшей характеристики. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как выбор на основе связывания, заключается в том, что он позволяет выбирать варианты, которые подавляют токсичность субстрата, связанного с заболеванием.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сворачивания белка, выявив белки, которые могут обратить вспять неправильное сворачивание белка. Хотя этот метод может дать представление о потенцировании HS P 1 0 4, он также может быть применен для скрининга библиотек любого белка на предмет подавления токсичности любого субстрата, который токсичен в дрожжах. Для скрининга на подавление токсичности протеи начните с промывания колоний HSP 1 0 4 с планшетов с помощью дропаут-среды, обогащенной рафинозой, серологической пипеткой и стерильной древесиной, а аппликаторы переносят жидкость в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и тщательно обрабатывают колонии, чтобы отделить любые клеточные комки.

Затем разбавляют клеточную суспензию до слегка мутной культуры и выращивают клетки в течение ночи в среде с выпадением рафинозы при встряхивании при 30 градусах Цельсия. Выращивайте HSP 1 0 4 Дикий тип и вектор управления параллельно в это время. На следующей утренней пластине диапазон концентраций клеток на отдельных галактозных пластинах для создания по крайней мере одной пластины на группу с отдельными колониями.

Нормализуем вектор и HSP 1 0 4 мировых типа культур до наружного диаметра 600 библиотеки и планшета. Равные объемы этих клеток экспериментальным концентрациям штаммов для сравнения роста библиотеки относительно контрольной группы для оценки выбора. Строгость также помещает библиотеку на среды, подавляющие глюкозу, а затем инкубирует все планшеты в течение двух-трех дней при 30 градусах Цельсия до тех пор, пока колонии, по-видимому, не будут использовать пять FOA для отбора клеток, которые больше не поддерживают экспрессирующие плазмиды HSP 1 0 4, затем высадить одиночные колонии от каждого штамма в двух экземплярах на двойные и одиночные выпадающие медиа-планшеты за одну ночь инкубации при 30 градусах Цельсия.

Эти пластины будут использоваться для секвенирования позже, чтобы предотвратить высыхание пластин. Оберните SD шипящие европластины в пара-пленку и установите их при температуре четыре градуса Цельсия при одновременном выполнении пяти FOA screen. Затем разделите колонии с шипящих пластин SD на одиночные колонии на пяти пластинах FOA для одной-двухдневной инкубации при 30 градусах Цельсия до тех пор, пока не появятся одиночные колонии. Следующий.

Из каждой из пяти пластин FOA выберите и прорезайте. Три выжившие колонии на одну SD Euro и одну SD его пластину на каждую выжившую колонию после еще одного-двух дней инкубации при 30 градусах Цельсия. Колонии, потерявшие плазмиду HSP 1 0 4, будут расти на пластинах SD шипения, но не на пластинах SD Euro.

Вырастите эти штаммы до насыщения в средах с выпадением рафинозы в 96. Глубоко колодите две миллилитровые пластины на ночь при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием. Затем, чтобы исключить ложные срабатывания, проведите тест на мажущие выделения.

Ближе к концу инкубации используется многоканальная пипетка для сбора 200 микролитров фильтрующего материала для выпадения рафинозы на лунку на новый планшет на 96 лунок, резервируя первую и седьмую колонки для чистых культур. Далее аликвотируют по 250 микролитров каждой из 16 насыщенных культур в первую и седьмую колонки планшета и последовательно разводят культуры в пять раз в каждую колонку планшета, тщательно перемешивая многоканальной пипеткой. Затем, чтобы обеспечить равномерное пятнистость, удалите 50 микролитров разведенной культуры из столбцов 6 и 12, чтобы обеспечить конечный объем каждой лунки в 200 микролитров.

Затем с помощью 96-вольтового репликатора можно обнаружить культуры в дубликатах на пластинах шипения SD и шипения. После двух-трехдневной инкубации при 30 градусах Цельсия выберите для секвенирования штаммы, которые проявляют токсичность на шипящих планшетах. Как и в контрольной группе, ложноположительные штаммы, которые не так токсичны, как контрольные, можно отбросить.

Также отбраковывайте штаммы, которые демонстрируют дефект роста на sd. Его пластины или то или иное проявляют значительно большую токсичность, чем только болезнетворный субстрат. Чтобы секвенировать варианты HSP 1, 0 4 с помощью колонийной ПЦР, сначала соскребите примерно 10 микролитров дрожжей с европейских планшетов SD на три микролитра 20 миллигидроксида натрия в ПЦР-зачищенных пробирках, чтобы выровнять клетки путем замораживания.

Сначала поместите полоски в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Через 10 минут в морозильной камере инкубируйте пробирки при температуре 99 градусов Цельсия в термоамплификаторе в течение 10 минут, а затем разбавьте штаммы до 100 микролитров водой для ПЦР с использованием высокой концентрации праймера. Затем запустите стандартную программу ПЦР на образцах, а затем проанализируйте образцы с помощью агелэлектрофореза, чтобы подтвердить амплификацию продукта ПЦР А соответствующего размера.

Наконец, секвенируйте продукты ПЦР, тщательно анализируя хроматограммы секвенирования на наличие мутаций. Мутации могут наблюдаться в виде смеси двух нуклеотидов к данному участку, поскольку дрожжи часто содержат несколько плазмид. В этом репрезентативном эксперименте, после создания библиотеки из вариантов HSP 1 0 4, рандомизированных в среднем домене, библиотека была преобразована в дрожжи, содержащие плазмиду для индуцируемой галактозой экспрессии TDP 43.

Затем трансформанты восстанавливали и наносили на пластины с глюкозой и галактозой для оценки жесткости экрана. После пяти анализов на лечение FOA были проведены тесты на выявление подмножества вариантов, выбранных на первоначальном скрининге. Указано, что из четырех отобранных колоний в двух наблюдалось HSP 1 0 4, опосредованное подавлением токсичности TDP 43.

Один из них оказался ложноположительным, а другой показал повышенную токсичность. После пяти обработок FOA два истинных попадания были секвенированы с помощью ПЦР колоний для идентификации мутаций среднего домена. Эти мутации HS P 1 0 4 могут быть затем получены в родительской плазмиде HSP 1 0 4 путем направленного на сайт мутагенеза для подтверждения их подавления токсичности После освоения этого метода можно использовать для скрининга до 200 попаданий за один раз в пяти FO, с шагом в течение одной-двух недель, если он выполнен правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно тщательно проанализировать результаты секвенирования, так как после этой процедуры часто получаются смеси плазмид. Другие методы, такие как флуоресцентная микроскопия, могут быть выполнены, чтобы помочь ответить на дополнительные вопросы, такие как: как варианты HSP 1 0 4 влияют на агрегацию субстрата, связанного с заболеванием? После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить скрининг библиотек вариантов HSP 1 0 4 для выбора подавителей токсичности.