Долгосрочный длительной Визуализация мыши Cochlear эксплантов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы визуализировать эмбриональную улитку, взятую у флуоресцентной мыши-репортера с 30-минутными интервалами в течение пяти дней. Это достигается путем первого сбора эмбриональной улитки на 13-й день от флуоресцентных мышей-репортеров. Далее улитки культивируют in vitro.

Затем культуры кохлеарного эксплана помещают в микроскоп инкубатора. Наконец, настраивается автоматизированная процедура визуализации и визуализируется улитка E. В конечном счете, долгосрочная покадровая визуализация культур кохлеарного эксплана может быть использована для отображения морфогенетических движений кохлеарного эпителия в целом, а также изменений в экспрессии репортерных генов с течением времени и эффектов медленно действующих фармакологических агентов.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как ручное фотографирование культур фонда X в течение определенного периода времени, заключается в том, что эта система полностью автоматизирована. Это позволяет собирать больше временных точек и гарантирует, что одна и та же область улитки или набор клеток визуализируются в одной и той же ориентации в каждой временной точке, и все это при выращивании в инкубаторе для нерегулярных культур тканей. После дополнения модифицированной орлиной средой KO или DMEM и балансовым раствором соли Хэнка или HBSS в соответствии с сопроводительным текстовым протоколом.

Под ламинарным проточным колпаком используйте пять миллилитров unsu дополненного DMEM для ресуспендирования, 200 микролитров пипетки субстрата с базальной мембраной по 150 микролитров в центр каждой 10-миллиметровой лунки чашки для культуры со стеклянным дном диаметром 35 мм. Инкубировать в течение 40 минут в инкубаторе с СО2 при температуре 35 градусов Цельсия. Чтобы подготовить рабочую станцию и инструменты, включите ламинарный чистый стол и распылите на него 70% этанол и замочите щипцы, ложки и черную посуду с силиконовым покрытием.

На чистом рабочем месте заготавливают эмбрионы соответствующего срока беременности во льду. Холодный HBSS с добавлением 1% кучи. Используя флуоресцентный стереомикроскоп, определите эмбрионы, которые проявляют репортерную активность снаружи или внутри видимого органа, и перенесите их в свежий ледяной HBSS с 1%-ными кучами для сбора височных костей, используя холодный источник света и тонкие щипцы.

Работайте быстро, чтобы обрезать шейные позвонки и ниже челюсти, чтобы собрать головки. После сбора голов эмбрионов согласно текстовому протоколу осторожно вскрыть череп, затем удалить мозговую обрезку с передней части головы и перенести заднюю часть черепа в блюдо со свежим льдом. Холодный. HBSS скапливает, тщательно рассекает височные кости в форме арахиса, заботясь о сохранении вестибулярного аппарата в целости.

Чтобы рассечь улитку, перенесите височные кости в черную посуду с покрытием из силиконового эластомера в ледяные кучи HBSS. Закрепите вестибулярную область кости, вставив штифты под косым углом, чтобы стабилизировать височную кость и освободить место для щипцов. Затем осторожно удалите хрящ, окружающий улитку, вставив один узел щипцов в хрящ у внешнего края основания улитки и обрезав отверстие в хряще.

Зафиксируйте горизонтально сверху и по диагонали и осторожно снимите переднюю часть капсулы. Вставьте зубец щипцов между оставшимся хрящом и протоком и аккуратно отрежьте оставшийся хрящ. Апикальная поверхность улитки теперь обнажена.

Начиная с основания, захватите область, где крыша канала встречается с кохлеарным эпителием, и откройте улитковый канал. При необходимости аккуратно снимите обшивку крыши до полного снятия. Обрежьте все участки мембраны, оставшиеся на медиальной стороне протока.

Затем очистите проток от избытка мезенхимальной ткани и отсоедините проток от вестибулярной системы для культивирования имплантатов. Поместите одну световую поверхность вверх в центр чашки для культуры со стеклянным дном с субстратом. Осторожно слейте жидкость и оставьте на две минуты.

Затем по каплям. Добавьте 150 микролитров дополненного DMEM в эксплан X, стараясь не тревожить его, чтобы он мог осесть на субстрат. Поместите посуду со стеклянным дном в глубокую чашку Петри диаметром 12 сантиметров с небольшой посудой со стерильной водой для поддержания влажности.

Поместите культуры в инкубатор с температурой 35 градусов Цельсия на ночь, чтобы эксплан прикрепился к субстрату и расплющился для выполнения живой визуализации. После отбора образцов используйте флуоресцентный стереомикроскоп для оценки состояния каждой эксплантированной улитки и отбирайте только те экспланты, где проток не поврежден и прикреплен к стеклу от основания до верхушки. Установите в инкубаторе температуру 35 градусов Цельсия с 5% CO2 для культивирования.

Кохлеарную ткань мягко отсасывают дополненный DMEM из культур и заменяют его не менее чем 500 микролитрами в свежей среде. В тех случаях, когда экспланы прикреплены неплотно, сделайте пипетку кольцом среднего качества по краю посуды. Эта дополнительная жидкость позволит создать миниатюрную увлажненную камеру, не нарушая конструкцию, пока она продолжает прикрепляться к матрице.

Микроскоп в этом примере имеет вращающуюся платформу, которая вмещает 8 35-миллиметровых тарелок для образцов под ламинарным проточным колпаком. Замените пластиковые крышки стеклянными крышками и вставьте посуду в держатель для образцов блюд. При необходимости смены среды в ходе эксперимента.

Чтобы не нарушить пояснение, используйте откидные крышки для посуды, которые позволят открывать крышки, пока чашка остается на своем месте в микроскопе, поместите держатель чашки для образцов внутрь микроскопа инкубатора, стараясь не сместить экспонирование со дна чашки и не повредить среду. Чтобы настроить процедуру визуализации, включите микроскоп, УФ-лампу и камеру, а затем откройте программное обеспечение для обработки изображений. Для каждого найденного образца выберите плоскость фокусировки и экспозиции области визуализации, учитывая не только вид эксплана в момент начала, но и то, как ткань будет двигаться во время прогона.

В канале флуоресценции установите стек Z, центрирующийся вокруг выбранной фокальной плоскости. Затем задайте частоту и продолжительность выборки для эксперимента. Это время будет ограничено временем, необходимым для сбора изображений для создания фильма в конце периода замедленной съемки.

Используйте программное обеспечение, такое как METAMORPH, чтобы открыть файлы изображений для образца кадр за кадром. Выберите наилучшую фокальную плоскость для отображения интересующей популяции клеток. Наконец, преобразуйте изображения в файл dot a VI или экспортируйте их в виде монтажа, чтобы создать набор изображений, которые можно открыть и проанализировать в программном обеспечении для обработки изображений или конвертировать в другие форматы.

Здесь показан фильм, демонстрирующий, как будет расти органотипический кохлеарный эксплан при покрытии пластинами. На модели E 13.5 была использована мышь SOX с двумя репортерами, чтобы визуализировать сенсорную область, видимую зеленым цветом, в то время как клетки несенсорных областей делятся и перемещаются. Непролиферативная сенсорная область зеленого цвета претерпевает перестройку тканей и сходящиеся разгибательные движения.

Второй эксперимент с замедленной съемкой, сосредоточенный на среднем основании другого коглеарного эксплана, демонстрирует, что по мере его расширения плюсы сенсорной области сужаются при первом попадании в культуру. Толщина ткани позволяет идентифицировать области экспрессии, но не отдельные клетки.

Однако после трех дней культивирования ткань значительно сплющивается, что позволяет визуализировать отдельные флуоресцентные клетки после этой процедуры. Другие методы, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание или экстракция белков и РНК, могут быть выполнены для оценки изменений в экспрессии генов на молекулярном уровне. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как препарировать и культивировать улитку и как использовать микроскоп инкубатора для выполнения визуализации всего плана в реальном времени в течение нескольких дней.