Определение ключевых факторов, регулирующих самообновлению и дифференцировке в EML гемопоэтических клеток-предшественников по РНК секвенирования анализа

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении потенциальных ключевых регуляторов самообновления и дифференцировки EML-клеток мыши с использованием технологии секвенирования РНК. Это достигается путем разделения линейно-негативных CD-34-положительных и линейно-отрицательных CD-34-отрицательных EML-клеток на основе поверхностных маркеров. Второй шаг — выделение мРНК, преобразование мРНК в кДНК и подготовка библиотеки к секвенированию.

Затем библиотека ДНК подвергается высокопроизводительному секвенированию. Заключительным этапом является анализ результатов секвенирования и поиск дифференциально экспрессируемых факторов транскрипции. В конечном счете, технология секвенирования РНК используется для выявления дифференциально экспрессируемых факторов транскрипции в линейно-отрицательных CD 34 положительных клетках и линейно отрицательных CD 34 отрицательных EML.

Основное преимущество секвенирования РНК по сравнению с другими методами экспрессии G-пролена, такими как микрорентген, заключается в том, что оно обладает более высокой чувствительностью, точностью и более широким динамическим диапазоном, а также не зависит от ранее существовавшей информации об аннотации генов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток, например, каковы ключевые факторы транскриптов, регулирующие самообновление и дифференцировку клеток. Применение этого метода распространяется и на терапию заболеваний крови, поскольку лучшее понимание ключевого регулятора, контролирующего клетки-предшественники кроветворения, самообновление и дифференцировку могут привести к разработке эффективных методов лечения.

Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что для анализа секвенирования требуются различные инструменты биоинформатики. Почку детеныша хомяка или клетки BHK для сбора фактора стволовых клеток культивируют в среде dmem, содержащей 10% FBS на площади 25 квадратных сантиметров, колбе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. Когда клетки достигнут 80-90% конфлюенции трипсина глазами и соберут их центрифугированием при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре, отбросьте snat и повторно суспендируйте клеточную палитру в 10 миллилитрах свежей среды для культивирования клеток BHK.

Перелейте два миллилитра клеточной суспензии в новую колбу площадью 75 квадратных сантиметров и добавьте 48 миллилитров свежей клеточной культуры BHK. Средняя для колбы культуры. Ячейки BHK на двое суток.

Через двое суток соберите питательную среду и пропустите ее через пункт 45 микрометрового фильтра. Храните среду при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Мышиные эритроидные, миелоидные и лимфоцитарные или EML-клетки, используемые в этом протоколе, культивируют в суспензии в основной среде EML, содержащей среду для культивирования клеток BHK при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

Поддерживайте низкую плотность клеток EML с пиковой плотностью менее 600 000 клеток на миллилитр. Расщепляйте клетки каждые два-три дня в соотношении от одного до пяти пассажей к клеткам аккуратно, но не более чем на 10 поколений, чтобы истощить линейно-положительные клетки. Соберите клетки EML путем центрифугирования при давлении 200 G в течение пяти минут.

Промойте клетки один раз PBS и снова центрифугируйте после удаления надосадочной жидкости. Повторно суспензируйте клетки в PBS и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Количество клеток необходимо для определения концентрации антител на следующем этапе.

Выделите lineage negative или linenegative клетки с помощью коктейля lineage антител и системы сортировки магнитных активированных клеток в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы начать эту процедуру, понизьте лин-отрицательные клетки при давлении 200 G в течение пяти минут. Повторно суспендируйте клеточную гранулу с помощью PBS и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Дважды промойте ячейки с помощью буфера для факса. После второй промывки гранулируйте ячейки при 200 G в течение пяти минут. Промаркируйте пять пробирок микроцентрифуг объемом 1,5 миллилитров цифрами 1, 2, 3, 4 и пять соответственно.

Ресуспендируйте клетки с соответствующим объемом фактов буфера до концентрации 1 миллион клеток на 100 микролитров. Затем внесите по 100 микролитров клеточной суспензии в каждую из пяти микроцентрифужных пробирок. Добавьте один микрограмм антитела против мыши CD 34 FE в первую и вторую пробирки.

Перемешайте пробирки, аккуратно инкубируйте все пробирки при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа в темноте. Затем добавьте 25 микрограммов конъюгированной антики из ПЭ, одно антитело и 20 микролитров конъюгированной линии с ФК. Коктейль антител к двум одному, добавьте 25 мкг ПЭ конъюгированного антика одно антитело к пробирке три и 20 мкг конъюгированной линии ФК.

Коктейль антител к трубке четыре. Аккуратно перемешайте пробирки и инкубируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия еще 30 минут в темноте. Через 30 минут добавьте 300 микролитров факс-буфера во все пробирки и вращайте ячейки при давлении 200 G в течение пяти минут.

После окончательной промывки промойте ячейки три раза 500 микролитрами буфера для факса. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 500 микролитрах факс-буфера, изолируйте lin-отрицательные SCA-положительные CD-34-положительные и lin-отрицательные SCA-отрицательные CD-34-отрицательные клетки в первой пробирке методом флуоресцентной активированной сортировки клеток. Общая РНК экстрагируется из lin-отрицательных CD-34-положительных и lin-отрицательных CD-34-отрицательных клеток с помощью триола, а загрязненная ДНК удаляется с помощью дезоксирибонуклеазы.

Следуя протоколу производителя, оцените качество общей РНК с помощью биоанализатора, следуя инструкциям производителя, для экстракции мРНК и последующих процедур конструирования библиотеки используются только образцы РНК с числом целостности РНК или RIN более девяти. На этом рисунке показан результат получения высококачественного образца РНК с RIN, равным 9,4. Используемый здесь протокол построения библиотеки специфичен для платформы секвенирования РНК Illumina и использует набор для подготовки образцов РНК.

Следуйте инструкциям производителя, так как в этом видео показаны только некоторые шаги. Начните с положительного выбора поли МНК с помощью магнитных шариков oligo DT. Затем фрагментируйте поли-мРНК и выполняйте обратную транскрипцию с использованием случайных праймеров для преобразования мРНК в CD NA. Впоследствии синтезированная вторая цепь CD NA используется для получения двухцепочечной ДНК.

Затем три основных выступа удаляются, а пять основных выступов заполняются ДНК-полимеразой дената. Три основных конца фрагментов CD NA от лигирования друг к другу. Добавьте адаптеры мультиплексной индексации на оба конца двухцепочечного CD NA для секвенирования.

Наконец, проводят ПЦР для обогащения CD NA по фрагментам с помощью спектрофотометра, измеряют поглощение два 60 над поглощением два 80 амплифицированной ДНК. Для получения информации о концентрации библиотеки оцените качество библиотеки и измерьте диапазон размеров фрагментов ДНК с помощью биоанализатора. Методы анализа данных секвенирования РНК приведены в сопроводительном тексте протокола и включают обработку файлов данных для последующего анализа, обнаружения новых транскриптов и оценки уровня экспрессии, детектирования дифференциально экспрессируемых генов и идентификации дифференциально экспрессируемых факторов транскрипции.

Lineage negative EML клетки окрашивали антителами anti CD 34 antica one и lineage cocktail и lin negative skull positive CD 34 positive и lin negative sca. Отрицательные CD 34 отрицательные клетки разделяли только с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток. Лин-отрицательные клетки были закрыты для анализа экспрессии SCA one и CD 34.

На момент завершения строительства библиотеки наблюдались две популяции EML-клеток. Размер фрагментов ДНК в библиотеке проверяли с помощью биоанализатора. Эти репрезентативные данные показывают хорошее качество библиотеки, но размер фрагмента достигает максимума примерно в 300 пар оснований.

Алгоритм D-E-S-E-Q был использован для анализа дифференциальной экспрессии с акцентом на дифференциально экспрессируемые факторы транскрипции, поскольку факторы транскрипции имеют решающее значение для определения сульфата. Были обнаружены факторы транскрипции, которые изменяются более чем в 1,5 раза между lin-отрицательным CD 34 положительным и lin-отрицательным CD 34 отрицательным и показаны на этой тепловой карте. Примечательно, что относительный уровень экспрессии TCF 7 в lin-отрицательных CD 34 положительных клетках более чем в 100 раз выше, чем в lin негативных CD 34 негативных клетках.

Таким образом, TCF 7 был выбран для дальнейшего иммунопреципитации и секвенирования хроматина, анализа и функционального тестирования с целью подтверждения его функции в регуляции самообновления и дифференцировки в EML-клетках. После освоения библиотека РНК может быть завершена за несколько дней, а вся процедура может быть завершена примерно за месяц, если она будет выполнена правильно после ее разработки. Эта технология проложила путь для исследователей, которые готовы дифференцированно изучать экспрессию генов среди различных типов клеток и тканей, таких как В-клетки и злокачественные В-клетки.

Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о высоком уровне CAR TRNA, потому что он является основой всей процедуры лечения РНК. После просмотра этого видео у вас должно сложиться лучшее понимание того, как определить ключевые регуляторы, контролирующие обновление и дифференцировку клеток EML-клеток.