Синергетический использованием нейронных клеток-предшественников и самоорганизации пептидов в экспериментальном шейного отдела спинного мозга Травма

Общая цель этой процедуры заключается во внедрении модели компрессионного зажима для шейного отдела позвоночника у крыс у крыс, а также протокола комбинированного лечения, включающего инъекцию SAP и трансплантацию NPC. Сначала вокруг спинного мозга помещается зажим для аневризмы, который удерживается на месте в течение одной минуты. Это приводит к двусторонней контузионно-компрессионной травме.

Затем в эпицентр травмы вводятся SAP, NPC — сразу после инъекции SAP. Осмотический насос с субдуральным катетером вводится для устойчивой доставки факторов роста. Результатом этой процедуры является доставка NPC к поврежденному спинному мозгу.

Выживаемость и приживление NPC поддерживается комбинаторным лечением САП и факторами роста. Применение этого метода распространяется на терапию травматического повреждения спинного мозга, поскольку он обеспечивает клинически значимую модель, которая может быть использована для изучения клеточной терапии COMBINATOR, способствующей регенерации спинного мозга. Следующий экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными Университетской сети здравоохранения, Торонто, Канада, и соответствует политике, установленной в руководстве по уходу и использованию экспериментальных животных, подготовленном Канадским советом по уходу за животными.

Все хирургические процедуры должны выполняться в стерильных условиях с использованием стерильного оборудования и растворов, и в соответствии с рекомендациями учреждения и правительства, для этой процедуры используются крысы весом от 250 до 270 граммов перед началом процедуры. В день процедуры обеспечьте животных антибиотиками в питьевой воде в течение двух дней. После помещения крысы в анестезиологическую камеру и введения анестезии 5% ISO фтора в соотношении один к одному кислороду и закиси азота в течение одной минуты уменьшите ISO фтора до 1,8-2,2%. Нанесите ламбиковую мазь на глаза и подтвердите хирургическую анестезию, выполнив щипывание лапы.

Затем поместите крысу на нагретую подушку и зафиксируйте голову в стереотаксическую рамку с помощью носового обтекателя. После бритья шерсти вокруг шейного отдела позвоночника продезинфицируйте кожу путем тампонирования повидон-йодом, а затем 70% этанолом после выполнения разреза по средней линии от области С-двух шейных позвонков до выступающих отростков тела Т-двух грудных позвонков. Хирургическими ножницами разрежьте внешний слой мышц позвонка непосредственно по средней линии в направлении крэниола, хирургическими ножницами рассекайте более глубокие слои мышц до тех пор, пока не будут достигнуты процессис, осис и ламинат.

Вставьте транспортир и удерживайте. Откройте мышечные слои, затем сориентируйте выступающий processis posis тела Т-двух позвонков и определите целевые уровни для ламинэктомии. Затем с помощью скальпеля под номером 15 разрежьте связочный слой, чтобы ослабить ламини, и отросток пропитан.

Затем с помощью ножницы для кости разрежьте ламини латерально к спинному мозгу и аккуратно удалите ламини, не сдавливая спинной мозг. Теперь уделите немного времени, чтобы определить появляющиеся нервные корешки, чтобы избавить их от обрезания. Затем с помощью крючка ослабьте вентральную твердую мозговую оболочку со спинной стороны тел позвонков и подготовьте коридор для зажима.

Убедитесь, что кольцевая пружина зажима настроена на передачу желаемого усилия. Сила зажима определяет степень травмы и компрессии. Вставьте открытый зажим вокруг спинного мозга и дайте ему защелкнуться, чтобы вызвать ушиб.

Усилия клипсования от 15 до 35 граммов часто используются с продолжительностью клипсирования в одну минуту после травмы спинного мозга. Снимите зажим и сомкните мышцы в два слоя с последующим закрытием кожи. Как только рана будет должным образом закрыта, прекратите анестезию и наблюдайте за крысой, пока она просыпается.

После того как животное придет в себя в достаточной степени для того, чтобы находиться, лежаче, поместите крысу в чистую клетку. Из-за тяжести этого типа травмы крайне важно следовать следующим послеоперационным методам лечения. Во-первых, обязательно принимайте обезболивающие, такие как бупренорфин и мелоксикам, в течение трех-пяти дней в зависимости от симптомов.

Также предотвращают обезвоживание подкожно. Вводите от пяти до 10 миллилитров физиологического раствора два раза в день в течение трех дней и продолжайте добавлять антибиотики в питьевую воду в течение пяти дней. Послеоперационный. Сжимайте мочевой пузырь два-три раза в день до тех пор, пока устойчивое восстановление функции мочевого пузыря не станет очевидным даже после того, как животные выздоровеют.

Обязательно наблюдайте за оперированными животными на предмет неврологических дефицитов и физиологического состояния. Инъекция проводится через 14 дней после травмы спинного мозга. Перед началом операции приготовьте САП в концентрации 1% от массы на объем в стерильной воде и заполните стеклянный капилляр размером 100 микрометров, прикрепленный к шприцу Гамильтона.

С помощью раствора прикрепите шприц Гамильтона к стереотаксической раме. После обезболивания крысу закрепляют голову в стереотаксическую рамку и дезинфицируют место операции повидон-йодом и 70%-ным спиртом. Как и раньше, еще раз, после вскрытия кожи, аккуратно рассеките пару позвоночных мышц и вставьте ретракторы.

С помощью скальпеля No 15 удалите рубцовую ткань из твердой мозговой оболочки и повторно обнажите место поражения. Затем с помощью кончика острой иглы осторожно раскройте твердую мозговую оболочку. Наконец, стереотаксически вставьте стеклянный капилляр на глубину двух миллиметров в травмированный спинной мозг и введите САП.

После введения САП дайте капилляру оставаться в месте инъекции в течение одной минуты перед удалением, чтобы дать возможность ткани растянуться для размещения введенного раствора. Затем повторите инъекцию на следующем участке. Здесь NPC были выделены из паравентрикулярной зоны взрослой красной мыши DS и культивированы в соответствии с ранее опубликованными методиками.

Непосредственно перед микроинъекцией разведите NPC в питательной среде до концентрации 50 умно-10 до трети живых клеток на микролитр для трансплантации клеток и загрузите в стеклянный капилляр на шприц Гамильтона. NPC вводятся сразу после введения SAP. Для этого необходимо ввести стеклянный капилляр шприца Гамильтона на 0,2 миллиметра ростраль от места травмы и на 1,5 миллиметра ниже тыльной поверхности спинного мозга.

Вводите два микролитра клеточной суспензии со скоростью около 0,5 микролитра в минуту. После того, как первая инъекция будет завершена, дайте капилляру остаться в спинном мозге в течение одной минуты, как и раньше, затем втяните капилляр, переместите его на соседний участок и повторите процедуру инъекции. Подождав минуту, как и раньше, втяните капилляр и переместите его на два миллиметра к месту травмы.

Выполните два инъекции по два микролитра в это место. На этом изображении показаны все места инъекций относительно повреждения спинного мозга. Имплантация субдуральных миниосмотических насосов для поддержки фактора роста проводится сразу после инъекций NPC.

Сначала выберите место имплантации. Предпочтительными местами являются боковые фланги торакоабдоминальной области, чтобы избежать дискомфорта, вызванного самой помпой. После дезинфекции области, как и раньше, подготавливается подкожное углубление для насоса.

Далее выполняют пропускную ламинэктомию верхних или нижних позвонков, прилегающих к травме спинного мозга. В данном случае повреждение спинного мозга было выполнено при C 7 T one, и поэтому ламинэктомия выполняется при C 5. Теперь поместите насос в подкожное углубление, затем разрежьте катетер до необходимой длины и, наконец, используйте швы 6,0, чтобы закрепить его на паре позвоночных мышц.

Избегайте любых вывихов, связанных с движением. С помощью кончика острой иглы вскройте твердую мозговую оболочку ниже места ламинэктомии. Затем введите катетер в субдуральное пространство и позвольте ему скользить в направлении нянчи без сопротивления и без травмирования спинного мозга.

Теперь убедитесь, что катетер работает гладко и не имеет перегибов или складок, как показано здесь. Затем закройте мышцы слой за слоем с помощью швов или зажимов, а затем закройте кожу. Как только рана будет должным образом закрыта, прекратите анестезию и наблюдайте за животным, пока оно просыпается.

После того, как животное придет в сознание, достаточное для того, чтобы лежать, поместите крысу в чистую клетку. Обязательно соблюдайте все послеоперационные лечебные процедуры, включая наблюдение за животным и послеоперационное обезболивание. Проводите иммуносупрессивную терапию за два дня до инъекции NPC и в течение семи дней после трансплантации и до жертвы соответственно.

На этом снимке, полученном с помощью флуоресцентной микроскопии, показан продольный срез травмированного спинного мозга крысы. Окрашивание представляет собой флуоресцентные SAP-фильтры DPI, меченные QL 6. Плодинки имеют зеленый цвет и скапливаются в эпицентре поражения.

Введенные DS красные положительные NPC диффундировали в ростральном и детском направлениях, обозначенных красной флуоресценцией. Масштабная линейка представляет собой пять миллиметров. На снимке, полученном с помощью сканирующего электронного микроскопа, показано формирование скаффолда из нановолокна из собранных САП.

Масштабная линейка соответствует одному микрометру. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о хирургических процедурах, связанных с клипсовой компрессией, ТСМ, и о том, как в этой модели можно изучить перспективный подход комбинированного лечения с помощью САП и NPC.