Роман В пробирке Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

Общая цель этой процедуры заключается в изучении взаимодействий между кровью и эндотелиальными клетками с использованием нового анализа эндотелиальной камеры крови. Это достигается путем предварительного сбора крови у здорового добровольца с помощью открытой системы венепункции. На втором этапе кровь осторожно наслаивается на кровяные камеры, покрытые гепариновой поверхностью, в сочетании с предметными стеклами, покрытыми эндотелиальными клетками.

Затем эти камеры эндотелиальных клеток крови мягко вращаются, чтобы облегчить взаимодействие между кровью и эндотелиальными клетками. В конечном счете, межклеточные взаимодействия между кровью и эндотелиальными клетками и результирующая продукция тромбинового антитромбинового комплекса могут быть оценены с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и Элизы соответственно. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как использование животных моделей, заключается в том, что здесь можно использовать человеческую модельную систему для исследования сосудистых заболеваний до начала эксперимента.

Соедините иглу для подкожных инъекций 18 калибра с двухмиллиметровым куском силиконовой трубки внутреннего диаметра с покрытием из гепариновой поверхности. Пластиковые поверхности покрыты гепарином для предотвращения неспецифической активации коагуляции. Например, на этом изображении в этой камере без покрытия хорошо виден сгусток.

После 30 минут контакта с кровью обработка камеры гепариновой поверхностью защищает кровь от неконтролируемой активации, гарантируя, что результаты обусловлены взаимодействием эндотелиальных клеток крови. Только после подключения трубки тщательно соберите образец крови у здорового донора методом венепункции открытой системы в 50-миллилитровую пробирку с гепариновым покрытием. Дополните собранную кровь нефракционированным гепарином до конечной концентрации 0,75 МЕ на миллилитр и переверните пробирку два-три раза для бережного перемешивания.

Для анализа исходной концентрации белка крови тщательно перемешайте один миллилитр крови на пробирку в микроцентрифужных пробирках, содержащих 30 микролитров 10 миллимолярных К трех ЭДТА, и поместите пробирки на лед. Затем используйте наконечник пипетки с гепариновым покрытием для переноса 1,5 миллилитров крови в каждую камеру эндотелиальных клеток крови, покрытых гепариновой поверхностью, стараясь позволить крови течь медленно и без образования пузырьков, чтобы избежать активации. Далее удалите пластиковые стенки с предметных стекол для эндотелиальных клеток в соответствии с инструкцией производителя, и аккуратно промойте эндотелиальные клетки.

С помощью PBS мы перемещаем как можно большую часть смывателя из клеток, не давая культурам высохнуть, и размещаем предметные стекла в верхней части камер с кровью так, чтобы клетки были обращены к крови. Затем с помощью пластиковых горок для дополнительной поддержки. Чтобы избежать поломки предметных стекол клеточной культуры, поместите зажим вокруг каждой камеры эндотелиальных клеток крови, чтобы зафиксировать предметные стекла.

Теперь вращайте камеры на вращающемся колесе в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия при 0,5 G в течение 30 минут. После вращения демонтировать камеры эндотелиальных клеток крови, промыть предметные стекла клеточной культуры в PBS и зафиксировать клетки в ледяном 1%-ном паральдегиде на 10 минут. Наконец, для оценки концентрации активированного белка крови смешайте по одному миллилитру крови из каждой камеры в микроцентрифужных пробирках, содержащих 30 микролитров 0,34 моляра К три ЭДТА, и поместите пробирки на лед максимум на один час.

Затем, после вращения клеток, храните плазму в новых микроцентрифужных пробирках при температуре минус 70 градусов Цельсия до дальнейшего анализа. Активация факторов свертывания крови с большей вероятностью происходит в застоявшейся крови, так как вероятность взаимодействия между активированными факторами увеличивается. Действительно, объем крови без какого-либо движения пузырьков воздуха в два с половиной раза больше.

При добавлении в камеру 1,75 миллилитров крови по сравнению с 1,5 миллилитрами крови, измеренные значения тромбинового антитромбина свидетельствуют о повышенном образовании тромбинового антитромбина при увеличении объема крови. Интересно, что при инкубации с любым объемом цельной крови не отмечается никаких различий между двумя группами, что позволяет предположить, что эндотелиальные клетки могут модулировать активацию свертываемости для изучения влияния TNF альфа на рекрутирование лейкоцитов. В этом эксперименте qve обрабатывали 20 нанограммами на миллилитр TT NF альфа за четыре часа до контакта с кровью, после чего количественно определяли количество CD 16 положительных клеток.

Рекрутирование CD16 положительных клеток значительно увеличивалось при лечении TNF альфа со 100 до 256 CD 16 положительных клеток на квадратный миллиметр и 1,5 литра крови, а также со 172 до 378 и 1,75 миллилитров крови. Затем измеряли образование тромбиновых антитромбиновых комплексов в соответствующих образцах плазмы крови, инкубированной с обработанными ФНО альфа или необработанными клетками. Как и ожидалось, стимулированные ФНО альфа клетки индуцировали приблизительное удвоение антитромбиновых комплексов по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения.

Этот метод поможет исследователям в области иммунологии исследовать, дополнять и коагуляцию in vitro с использованием первичных клеток человека и цельной крови человека.