Инфильтрации центрифугирования Техника для извлечения апопластической Жидкость из листьев растений, используя Phaseolus обыкновенная Как пример

Целью данной процедуры является демонстрация экстракции апластической жидкости из листьев растений с использованием метода инфильтрационного центрифугирования. Это достигается путем предварительного погружения листа в инфильтрационную жидкость и использования разницы в давлении, создаваемой с помощью шприца или вакуумного насоса, для его полного проникновения. Вторым этапом является подготовка листа к центрифугированию с помощью вспомогательного аппарата.

Далее лист аккуратно центрифугируется для получения моющей жидкости APO plast. Заключительным этапом является определение коэффициента разбавления пласта APO и анализ качества промывочной жидкости alast. В конечном счете, анализ инфильтрационного центрифугирования используется для получения репрезентативных образцов APO plast, которые могут быть использованы для различных последующих анализов.

Основное преимущество этой методики по сравнению с другими существующими методами заключается в том, что ее легко оптимизировать для различных типов листьев с целью получения образцов верхнего плюса, имеющих минимальную контаминацию цитоплазматическими соединениями. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в таких областях, как физиология растений и взаимодействие растительных микробов, где важно понять, как состав APL изменяется у разных растений и меняется при различных физиологических условиях или стрессах. В качестве первого шага примите меры предосторожности, надев лабораторный халат, перчатки и очки.

Далее приготовьте объем дистиллированной воды, в которую нужно погрузить образец листа. Имейте наготове лезвие бритвы, чтобы собрать образец, в данном случае лист с сорта фасоли нежно-зеленого цвета. Приложите лезвие бритвы к домашнему листу и прикрепите лист от растения.

После сбора погрузите только что вырезанный лист в дистиллированную воду, чтобы удалить загрязнения с поверхности листа. Затем используйте впитывающую салфетку или бумагу, чтобы аккуратно перекрыть лист сухим. Измерьте вес листьев, прежде чем приступать к инфильтрации.

Это поможет в дальнейшем приблизить объем инфильтрации. Начните процесс инфильтрации с помощью шприца объемом 60 миллилитров. Сняв поршень, осторожно скатайте и/или сложите лист в шприц.

Далее наполните шприц инфильтрационной жидкостью. Здесь используется дистиллированная вода. Вставьте поршень и переверните шприц, чтобы выпустить воздух из него.

Обратите внимание на цвет листьев для последующего сравнения. Переместите поршень на отметку 40 миллилитров с помощью небольшого кусочка para para. Накройте кончик шприца.

Затем потяните поршень до отметки 60 миллилитров, чтобы создать отрицательное давление. Переверните шприц, чтобы выпустить пузырьки воздуха с поверхности листа. Медленно верните поршень в исходное положение в течение примерно двух секунд.

Откройте кончик шприца и выпустите воздух. Затем снова накройте кончик и нажмите на поршень, чтобы создать умеренное положительное давление. Продолжайте оказывать отрицательное давление, выбрасывая воздух, и применяйте положительное давление до тех пор, пока лист полностью не будет инфильтрирован.

Свидетельством полного инфильтрата является затемненный цвет инфильтрированных участков. Как только это станет заметно, удалите лист из шприца. Аккуратно закройте лист впитывающей бумагой, чтобы удалить поверхностную жидкость.

Затем измерьте вес инфильтрированного листа, а альтернативный метод инфильтрации использует вакуумную колбу. Снова соберите лист и промойте его в дистиллированной воде. После сушки измерьте вес листа.

Приобретите флягу для пистолета с минимальной емкостью 250 миллилитров. Поместите лист в колбу и залейте ее дистиллированной водой. Далее поместите в колбу пробку и прикрепите к пистолету вакуумный насос.

Подайте вакуум на колбу на время, достаточное для достижения давления. Примерно 650 миллиметров ртутного столба. Осторожно перемешивайте колбу, чтобы выпустить пузырьки воздуха из листа, находясь под пониженным давлением.

Затем осторожно и медленно отпускайте вакуум в течение примерно 10 секунд. Повторите процесс подачи вакуума, перемешивая колбу и отпуская вакуум до тех пор, пока лист полностью не проникнет. Свидетельством полного инфильтрата является затемненный цвет инфильтрированных участков.

Извлеките полностью пропитанный лист из колбы и аккуратно промокните лист впитывающей бумагой. Чтобы удалить поверхностную жидкость, измерьте вес инфильтрированного листа, чтобы можно было определить приблизительный объем инфильтрации. После того, как лист будет полностью инфильтрирован, подготовьте его к центрифугированию.

Разложите кусок пара-пленки шириной четыре дюйма. Поместите лист на пара-пленку. Затем с помощью пятимиллилитрового наконечника для пипетки сверните лист в пара-пленку.

Возьмите корпус шприца объемом 20 миллилитров со снятым поршенем и вставьте свернутый лист с помощью наконечника пипетки. Расположите все края срезанных листьев и лицом к концу поршня. Приобретите полиэтиленовую или поликарбонатную трубку объемом 50 миллилитров и вставьте в нее шприц.

Используйте центрифугу с качающимся ротором ведра. Загрузите пробирку с инфильтрированным листом и центрифугу с температурой четыре градуса Цельсия и 1000 G на 10 минут. После центрифугирования осмотрите лист, чтобы определить, была ли выведена большая часть инфильтрационной жидкости.

Пробирка центрифуги теперь содержит восстановленную промывочную жидкость APO plast, продолжая пипетировать восстановленную последнюю промывочную жидкость в свежие пробирки объемом 1,5 миллилитров. Поместите образцы промывочной жидкости APO plast в центрифугу и вращайте при 15 000 G в течение пяти минут, чтобы удалить все клетки или твердые частицы. После центрифугирования пипеткой пипетируйте супинат в свежие пробирки.

Держите образцы на льду до тех пор, пока он не сможет храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Одним из методов оценки качества промывочной жидкости APO plat является расчет коэффициента разбавления APO plat. Для этого приготовьте два объема инфильтрационной жидкости дистиллированной воды, в этом случае каждый достаточный для нескольких инфильтраций на один объем.

Добавьте порошок индигокармина до конечной концентрации 50 микромоляров. Ничего не добавляйте к другому. Получите микропланшет на 96 лунок, заполните три лунки 200 микролитрами инфильтрационного раствора.

С индигокармином заполните еще три микролитра 200 микролитрами чистого инфильтрационного раствора на микропланшете в считывателе, чтобы измерить абсорбцию каждой жидкости. При 610 нанометрах средняя абсорбция для жидкости с индигокармином минус средняя абсорбент для жидкости без дает скорректированную абсорбцию инфильтрата. Затем повторите протокол инфильтрации листьев три раза для каждого из решений по инфильтрации.

Погрузите образец листьев в воду. Применяйте отрицательное и положительное давление при использовании инфильтрационного раствора индигокармина, промойте листья в дистиллированной воде после инфильтрации, чтобы удалить остатки индигокармина с поверхности листьев. Восстановите остатки промывочной жидкости с помощью центрифугирования.

После восстановления последней промывочной жидкости вернитесь к планшету считывателя в лунки микропланшета. Помещается по 200 микролитров каждого из экстрактов индигокармина без экстракта, а также по 200 микролитров каждого экстракта индигокармина в качестве жидкости для промывки. Измерьте поглощение образцов на 610 нанометрах, чтобы получить скорректированное поглощение.

Усредните каждый набор чисел и возьмите разницу. Используйте скорректированную абсорбцию инфильтрата и скорректированную абсорбцию апластической промывочной жидкости для определения коэффициента разбавления APL для получения оценок концентраций или активности в апластической жидкости. Implanter умножает значения концентрации или активности жидкости для промывки на коэффициент разбавления, извлеченный из жидкости для промывки last из сорта fasi vulgaris.

Нежный зеленый цвет был использован для получения этого газохроматографии масс-спектра органических кислот. Простые сахара и аминокислоты составляют основную часть идентифицируемых метаболитов. Вот сравнение страницы SDS, гели для окрашивания Кумаси из экстрактов листьев fasi vulgarus alast washing fluid

Экстракции различаются по величине цитоплазматического загрязнения. При этом наблюдается разное количество гипсового фермента рубиса. При выполнении этой процедуры важно помнить, что нужно быть как можно более осторожным, чтобы не вызвать повреждение тканей или цитоплазматическое загрязнение после этой процедуры.

Другие методы, такие как масс-спектрометрия белков или метаболитов, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся состава апластической жидкости. Апластическая промывочная жидкость также может быть использована в качестве грубой среды для изучения влияния апластических химикатов на микроорганизмы, колонизирующие ткани растений.