Электронной микроскопии высокого разрешения из Helicobacter Pylori Cag Тип IV секреции Система Пили Выпускается в различных условиях железного Наличие

Процедура визуализирует гиперпродукцию системы секреции CAG четвертого типа pii, которая происходит в условиях ограничения железа, первая культура H. pylori в условиях ограничения железа. Вторым шагом является совместное культивирование H. pylori с эпителиальными клетками желудка. Далее обрабатывают сокультуральные образцы для сканирующей электронной микроскопии.

В конечном счете, сканирующая электронная микроскопия с высоким разрешением, используемая для того, чтобы показать повышенную секрецию системы ЦАГ четвертого типа в условиях ограничения железа. Методика, описанная в данной рукописи, важна для заболеваний, связанных с H. pylori, таких как рак желудка, поскольку система секреции ЦАГ четвертого типа связана с повышенным риском негативных исходов заболевания. Таким образом, улучшается понимание регуляции этой важной бактериальной поверхности.

Органеллы могут выявить новые химиотерапевтические мишени А преимущество сканирующей электронной микроскопии с высоким разрешением по сравнению с существующими методами, такими как флуоресцентная микроскопия, заключается в том, что можно визуализировать отдельные таблетки секреции четвертого типа. У людей, плохо знакомых с этим методом электронной микроскопии, возникают проблемы с процедурой, особенно с влажной химией, поскольку она требует тщательного расчета времени и деликатной работы с кровью. Растут пластинки агара.

H. Pylori PMs, бактерии Sone и их изогенный мутант CAG e, у которого отсутствует функционирующая система секреции четвертого типа. Инокулируйте культуры и модифицированный бульон Ella с добавлением холестерина для выращивания в течение ночи. Затем засейте ГС эпителиальные клетки желудка человека на покрытие, обработанное полилизином, вставляйте его в 12-луночные планшеты для различных условий доступности железа.

Разбавьте H. pylori до оптической плотности 600 0,3 в модифицированном бульоне бру. Среда, содержащая 100 микромоляров хлорида железа, 200 микромоляров синтетического хератора железа Диппера или 200 микромоляров Диппера плюс 200 микромоляров культуры хлорида железа. Образцы в течение четырех часов центрифугируют бактерии при давлении 1000 G, а Resus суспендирует гранулы в равном объеме свежего модифицированного бульона бру с добавлением холестерина.

Измерьте бактериальную плотность. Затем инфицируйте эпителиальные клетки H. pylori при кратности инфекции 20 к одному. Выполните серийные разведения и поместите бактериальные клетки на кровяные агаровые пластины.

Чтобы оценить жизнеспособность бактериальных клеток, поместите сокультуры в инкубатор для клеточных культур на четыре часа. Сцедите надосадочную жидкость из культур H. pylori I и a GS co. Аккуратно промойте адгезивные клетки три раза 0,05 молярного буфера с натриевым покрытием

Затем зафиксируйте образцы на два-четыре часа при комнатной температуре. Затем промойте образцы три раза с 0,05 молярного буфера для покрытия натрия. Для вторичной фиксации добавьте 0,1% тетраоксида осмия в 0,05 молярного буфера с покрытием натрия ca в два последовательных 10-минутных этапа фиксации.

Затем после трех промывок обезвоживайте образцы с повышенными концентрациями этанола. Поместите образцы в сушильную машину для критических точек, затем заполните камеру жидким углекислым газом. Этанол выдувается из камеры и камера снова заполняется жидким углекислым газом.

Затем образец доводится до критической точки 31,1 градуса Цельсия и 1073 фунта на квадратный дюйм Теперь устанавливают защитные стекла на алюминиевые заглушки для образцов SEM и рисуют тонкую линию коллоидного серебра на краю образца для заземления. Во время СЭМ-визуализации, используя машину для нанесения покрытия, покройте образцы пятью нанометрами золотого палладия, чтобы увеличить сигнал вторичных электронов образца и краевой эффект. Исследуйте образцы с помощью полевого эмиссионного пистолета сканирующим электронным микроскопом изображения в режиме высокого вакуума на рабочем расстоянии от пяти до 10 миллиметров.

Установите ускоряющее напряжение на пять киловольт. Затем установите размер пятна на два на 2,5. Теперь наклоните образец от 15 до 25 градусов, чтобы добиться лучшего обзора границы раздела патогена хозяина для просмотра с большим увеличением.

Отдайте приоритет визуализации бактерий, прилипающих к краям эпителиальных клеток для PI, согревающих жизнь бактерий, обогащенных взаимодействием с патогенами хозяина. Откройте файлы микрофотографий в программе image J. Идентификация pi li по мере формирования структур между бактериальной клеткой и клеткой-хозяином с равномерной шириной от 10 до 13 нанометров и длиной от 60 до 150 нанометров.

Откалибруйте измерительный инструмент, нарисовав линию с помощью инструмента прямой линии, а затем щелкнув вкладку «Анализ» в раскрывающемся меню. Выберите «Установить масштаб» и введите значение полосы увеличения под известным расстоянием, а также установите единицу длины в нанометр. Затем нажмите OK.

Теперь с помощью инструмента «Прямая линия» нарисуйте по длине или ширине пилотов, а затем нажмите клавишу M, чтобы измерить каждого пилота и записать измеренные значения в программу для работы с электронными таблицами. Используйте ранее установленные параметры длины и ширины, чтобы игнорировать функции, которые не соответствуют профилю системы секреции CAG типа четыре. Затем количественно определите количество PI I на основе значений, которые находятся в пределах допустимого диапазона, проанализируйте количественную оценку PI LI с помощью двустороннего Т-критерия Стьюдента.

В этом эксперименте H. pylori культивировали в условиях обедненного железом с использованием синтетического хелатора dip parital в концентрациях, которые существенно не ингибируют рост. Бактерии продуцировали многочисленные PII системы секреции CAG четвертого типа при совместном культивировании с клетками желудка человека. И наоборот, при наличии экзогенного источника питательного железа образование PII системы секреции CAG четвертого типа подавляется.

Количественное определение PII на границе патогена хозяина показывает, что в условиях ограничения железа H. pylori демонстрирует двукратное увеличение PI глаза системы секреции CAG четвертого типа, процент пилеированных клеток увеличивается на 11% по сравнению с клетками, выращенными только в среде. Интересно, что, хотя активность системы секреции CAG четвертого типа, измеряемая секрецией IL 8-го хозяина, усиливается в условиях ограничения железа и подавляется в условиях избыточной доступности железа, размеры PI LI остаются неизменными при всех условиях доступности железа. В соответствии с участием системы секреции CAG четвертого типа, доступность железа не изменяет биогенез PI LI на поверхности мутанта CAG e после его развития.

Этот метод SEM проложил путь исследователям в области системы секреции CAG четвертого типа для изучения локализации белка. Что касается системы секреции CAG типа четыре. Недавно было обнаружено, что эффекторный белок CAG a локализуется на кончике таблетки для секреции четвертого типа.