Оценка лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействий в условиях протекают в Ex Vivo Autoperfused Microflow палата Анализ

Общая цель этой процедуры заключается в создании артериовенозного замкнутого контура ex vivo для оценки взаимодействия лейкоцитов с эндотелиальными молекулами адгезии в условиях физиологического потока. Это достигается путем предварительного покрытия тонкой стеклянной камеры интересующей молекулой эндотелиальной адгезии. На втором этапе полиэтиленовые и силиконовые трубки подключаются к камере, а затем хирургическим путем к мыши.

Далее кровь из сонной артерии по мере пропускания пропускается через трубку. А последующие взаимодействия нативных лейкоцитов с камерой с покрытием фиксируются в режиме реального времени. В конечном счете, влияние различных методов лечения на смещение и скорость вращения лейкоцитов при взаимодействии с иммобилизованными молекулами адгезии может быть рассчитано с течением времени.

Основное преимущество этой методики перед существующей методикой, такой как процитометрический анализ, заключается в том, что с помощью этой методики оценивается взаимодействие лейкоцитов с эндотелиальными молекулами в условиях физиологического течения. За день до эксперимента подсоедините один сантиметр полиэтиленовой трубки PE 10 к шестисантиметровому куску силиконовой трубки, а затем пять сантиметров полиэтиленовой трубки. Чтобы подготовить трубку для яремной стороны животного и для сонной артерии, соедините трубку, как только что было показано, с добавлением TTU в шестисантиметровую силиконовую трубку, примерно в 1,5 сантиметрах от односантиметровой полиэтиленовой трубки.

Затем подсоедините один конец 10-сантиметрового куска силиконовой трубки к датчику давления и вставьте Т-образный конец Т-образной трубки сонной артерии в другой конец. Убедитесь, что места соединения плотно прилегают и не протекают. Затем с помощью одномиллилитрового шприца, подключенного к игле 25 калибра, введите в каждую микропроточную камеру свежеприготовленный белок эндотелиального поверхностного покрытия, представляющий интерес, и храните покрытые камеры в 15-миллилитровой пробирке при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи на следующий день.

Чтобы подсоединить яремную и сонную трубки к камере микропотока, подсоедините силиконовые трубки по одному сантиметру с каждой стороны камеры, а затем запечатайте соединения небольшим прямоугольным кусочком парама, натянутым на то, чтобы трубка соприкасалась с камерой. С помощью шприца заполните камеру и трубку 0,1% бычьего сывороточного альбумина. А затем, проверив на герметичность, инкубировать в камеру в течение 45 минут.

При комнатной температуре ближе к концу инкубации стабилизируйте микропоточную камеру на выемке до чашки Петри с небольшой каплей силикона на каждой выемке. Затем соедините яремные и сонные трубки с каждой стороны камеры. Затем, пока силикон сохнет, подсоедините стопорный шприц 60 мил, наполненный гепарином, к датчику давления и пропустите гепарин марки 100 USP через трубку и камеру до тех пор, пока не останутся пузырьки воздуха.

Перед подключением мыши к камере микропотока включите компьютер, микроскоп и соответствующее устройство регистрации давления. После того, как программное обеспечение будет настроено, приобретите мышь возрастом от 10 до 12 недель. В вентральном положении сделайте разрез в области шеи ножницами, а затем рассеките щитовидную железу, чтобы обнажить трахею и сосуды.

Очистите сонную артерию до полного обнажения. Соблюдайте осторожность, чтобы не повредить блуждающий нерв. Затем пропустите изгиб сложенного куска шовной нити под сонной артерией и разрежьте шов на сгибе.

Таким образом, под артерией находятся два куска швов. Закрутите каждый шов в узлы, не затягивая, а затем таким же образом наложите швы на левую яремную вену. Когда яремные швы будут на месте, введите один миллилитр гепарина в мышиный ип.

После инъекции затяните верхний шов на сонной артерии и поместите зажим сосуда как можно ниже на открытый участок артерии. Используйте щипцы, чтобы удерживать артерию за верхний шов, а затем с помощью тонких микроножниц сделайте небольшой разрез примерно в одну восьмую окружности артерии рядом с верхним швом. Теперь вставьте трубку сонной артерии с помощью держателя трубки через разрез, сделанный в артерии, и пропустите его вниз нижним швом.

Затем завяжите нижний шов, а затем верхний. Так артерию запаивают вокруг трубки, делая несколько узлов для обеспечения плотного прилегания. Повторив ту же процедуру для яремной трубки, за вычетом зажима для сосудов, временно откройте зажим для сосудов на трубке сонной артерии, чтобы проверить кровоток.

Если утечек нет, переместите мышь к микроскопу и подсоедините трубку сонной и яремной вен к трубке камеры микропотока, чтобы зарегистрировать скорость прокатки лейкоцитов через камеру микропотока. Полностью отпустите зажим сонной артерии, чтобы заполнить камеру. Дайте крови циркулировать в течение трех-пяти минут, чтобы условия потока стабилизировались.

Тем временем отрегулируйте предметный столик микроскопа так, чтобы камера находилась на одном уровне с объективом микроскопа, а ее край был параллелен окну видеозаписи на экране. Затем соберите чашку Петри с водой комнатной температуры, а затем опустите в чашку объектив для погружения в воду с 10-кратным углом так, чтобы были видны клетки, проходящие через камеру, регулируя интенсивность света соответствующим образом, чтобы имитировать физиологическое давление потока среды, отрегулируйте зажим на трубке так, чтобы датчик показывал стабильные 30 миллиметров ртутного столба. Затем нажмите «Старт», чтобы начать запись как трафика лейкоцитов, так и давления, с первым временным интервалом вблизи яремного конца камеры и двигаясь против потока к сонному концу до полного завершения.

Когда запись будет завершена, закройте клапан в месте ввода, чтобы остановить кровоток, и замените камеру на новую камеру, покрытую другой молекулой адгезии, если это необходимо. Во время каждой записи в камере видны только взаимодействующие лейкоциты. Например, на каждом из этих изображений белые стрелки указывают на отдельные лейкоциты, которые были захвачены интересующей молекулой адгезии и которые катятся по камере среди других свободно текущих клеток.

В потоке крови можно увидеть общий артефакт за пределами камеры с большими темными сферами на всех изображениях, что может помочь зрителю оценить движение лейкоцитов по отношению к фиксированной точке. На графике показан окончательный график данных. При первом экспериментальном лечении наблюдалось уменьшение скорости качения, что проявлялось в виде сдвига влево, а при втором экспериментальном лечении наблюдалось увеличение скорости, проявляющейся в виде сдвига вправо, как по сравнению с контрольной скоростью качения в сочетании с этой процедурой.

Другой метод, такой как маркировка лейкоцитов и vivo x Viva, может быть использован для дальнейшего ответа на другие вопросы, такие как вклад определенного подтипа лейкоцитов в прогрессирование заболевания.