Флуоресценции основе удлинения праймера методики определения транскрипционных отправных точках и сайты расщепления РНКаз В Vivo

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации транскрипционных начальных точек и сайтов расщепления РНК in vivo у бактерий с помощью реакции удлинения флуоресцентного праймера. Это достигается путем первого выращивания бактерий, таких как кишечная палочка или Saria, и выделения молекул РНК. Затем РНК подвергается обратной транскрипции с использованием специфических флуоресцентных праймеров и обратной транскриптазы, в результате чего образуются фрагменты CD NA.

Затем из бактериальных клеток выделяют ДНК или плазмиды, и из матрицы ДНК с помощью набора для секвенирования создается флуоресцентная лестница секвенирования по Сэнгеру. Наконец, фрагменты CDNA и лестницы секвенирования разделяют и одновременно детектируют на полиакриламидном геле с помощью автоматизированного секвенсора геля и сравнивают друг с другом. В конечном счете, флуоресцентное удлинение праймера используется для картирования пяти основных концов молекул РНК с разрешением до одного основания.

Основным преимуществом этого метода по сравнению с другими методами, такими как первичное удлинение на основе расы или радиоактивности, является быстрая идентификация пяти с концов молекул РНК, поскольку обнаружение происходит одновременно во время электрофореза. Чувствительность аналогична первичным расширениям на основе красной активности, но позволяет персоналу лаборатории использовать этот метод без необходимости обучения радиационной безопасности. Мы успешно использовали этот флуоресцентный метод первичного удлинения для исследования компонентов РНК антитоксиновых систем токсинов.

Демонстрировать процедуру стафилококков будет Кристофер Шустер, аспирант из моей лаборатории. После получения высокого выхода РНК и проектирования праймеров в соответствии с текстовым протоколом проведите реакцию удлинения праймера путем предварительного нагрева термоамплификатора до 95 градусов Цельсия. Для каждого образца РНК смешайте следующие соединения в ПЦР-пробирке, денатурируйте образцы в течение одной минуты при температуре 95 градусов Цельсия.

Затем поместите пробирки на лед на пять минут, чтобы гибридизировать праймеры и РНК. Далее установите ПЦР-аппарат на 47 градусов Цельсия. Затем приготовьте мастер-микс обратной транскрипции, как описано здесь.

Добавьте четыре микролитра, мастер-смесь обратной транскрипции, к каждому гибридизованному образцу РНК и инкубируйте пробирки в течение одного часа при температуре 47 градусов Цельсия. Чтобы остановить реакцию, нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия в течение двух минут. Затем добавьте шесть микролитров красителя для загрузки амида и храните ночь или до двух недель в темноте при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

После подготовки геномной ДНК или плазмид, в соответствии с текстовым протоколом, соберите реакцию секвенирования по Сэнгеру, смешав 12 микролитров примерно от 10 до 15 микрограммов геномной ДНК или от 100 до 500 нанограммов плазмидной ДНК с одним микролитром флуоресцентно меченного праймера и одним микролитром пипетки ДМСО. По одному микролитру каждой смеси для секвенирования в отдельные предварительно маркированные ПЦР-пробирки. Затем добавьте по три микролитра грунтовочной смеси D-N-A-D-M-S-O в каждую пробирку.

Настройте ПЦР-машину на следующую программу и запустите ее после помещения образцов в машину. После прогона добавьте шесть микролитров загружающего красителя к образцам и затем на лед. При использовании сразу или при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение длительного времени с использованием чистых и непыльных 25-сантиметровых пластин поместите проставки 0,25 мм на заднюю стеклянную пластину и опустите стеклянную пластину с выемкой сверху, чтобы зубчатый конец стеклянных пластин и пилотов железнодорожного входа были обращены вверх.

Прикрепите гелевые рейки к обеим сторонам стеклянных пластин и слегка затяните ручки, чтобы отлить гель. Соедините перечисленные здесь соединения в стакане с мешалкой и положите на магнитную пластину для перемешивания. Сразу после добавления PS и совместной работы используйте 50-миллилитровый шприц, чтобы набрать раствор акриламида, и поместите фильтр 0,45 нанометра на наконечник.

Поместите сгруппированные пластины под углом от 10 до 20 градусов и медленно распределите раствор геля между стеклянными пластинами, непрерывно перемещая наконечник шприца с одной стороны на другую. Прекратите дозирование гелевого раствора, как только он достигнет нижнего конца стеклянных пластин. С помощью пузырчатого крючка удалите все пузырьки, которые могли образоваться.

Затем вставьте гелевую прокладку кармана между стеклянными пластинами на зубчатом конце, погрузив ее в раствор геля, и, зафиксировав его, прикрепив литейную пластину, слегка закрепите верхние рельсовые винты и дайте гелю застыть в течение одного-двух часов. Перед снятием литейной пластины и карманного распорки используйте дистиллированную деионизированную воду для очистки кармана от остатков соли и геля для протекания геля. Вставьте держатель буферного бака в гелевые рейки на передних стеклянных пластинах и затяните ручки.

Поместите гель в нижний гелевый бак автоматического тепловизора напротив нагревательной пластины и зафиксируйте, вставив пилот рельса в кронштейны аппарата. Используйте один буфер XTBE для заполнения верхней и нижней гелевых буферных камер. Затем закройте нижнюю буферную камеру и с помощью шнура питания подключите верхнюю буферную камеру к источнику питания.

Если в гелевом кармане присутствует соль, используйте буфер для многократного дозирования в карман для его очистки. Затем используйте верхнюю буферную крышку, чтобы закрыть верхнюю камеру буферного бака. После включения тепловизора и компьютера и запуска программного обеспечения для сбора данных базового ИК-излучения изображения в соответствии с текстовым протоколом, используйте перечисленные здесь настройки для настройки управления сканером.

Далее предварительно запустите пустой гель на 20 минут, выбрав напряжение и нажав Enter. Тем временем, используя ПЦР-машину, нагрейте лестницу секвенирования и продукты для наращивания праймера до 90 градусов Цельсия в течение двух минут Перед охлаждением на льду остановите электрофорез, откройте автоматический секвенсор геля и снимите верхнюю крышку буферного бака. Затем вставьте расческу с акульими зубьями между стеклянными пластинами и зубами акулы.

Слегка проткните в гелевой пипетке один-два микролитра праймера для наращивания средств или секвенирования лестничных реакций в каждый гелевый карман. Для любых пустых карманов. Используйте загрузочный краситель для их заполнения, чтобы предотвратить нестабильное поведение при работе, закройте буферный бак и дверцу секвенсора геля.

Затем запустите электрофорез, выбрав напряжение для лазера, выберите состояние сканирования и нажмите Enter. После того, как интересующая область пройдет через лазер, остановите электрофорез, как показано ниже. Реакция удлинения праймера может быть использована для определения начальных точек транскрипции или TSP интересующих транскриптов и может помочь вывести промоторные области.

В этом примере TSP мРНК МПЭ был идентифицирован как G, что согласуется с ранее опубликованными данными. Было выведено, что промоторные элементы минус 35 и минус 10 являются T-T-G-T-A-A и T-A-G-A-C-T, и эти мотивы отличаются только основаниями из каждой из их консенсусных последовательностей с использованием расширения праймера для идентификации продуктов расщепления мРНК. Здесь показано картирование РНК расщепления вблизи START co on с помощью РНК Ybi SEC two, когда РНК отсутствуют или неактивны, продукты расширения праймера не образуются вблизи START co on в результате активности РНК.

Тем не менее, две сильные полосы, появившиеся сразу после начального слоя на этом рисунке, показывают неудачный эксперимент по расширению праймера из-за избытка РНК в реакции обратной транскрипции, что препятствует идентификации отдельных полос. Это демонстрирует, что общее количество матричной РНК должно быть скорректировано в соответствии с обилием интересующей РНК. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как выяснить начальные точки транскрипции и сайты расщепления РНК in vivo с помощью флуоресцентных праймеров и автоматизированного секвенсора геля, а также немного попрактиковаться.

Этот способ быстро и легко выполнить. Удачи в ваших экспериментах.