Оптимизация пристрастие к мезенхимальных стволовых клеток человека на поли (ε-капролактон) Electrospun пряжи

В этой процедуре электровращающиеся каркасы PCL настраиваются различными способами для определения оптимальной конфигурации засева ячеек. Во-первых, стерильные каркасы помещаются в различные исследуемые установки, включая вставки для клеточных культур, желоба и вращающиеся сосуды биореактора. После установки известное количество клеток засевается на каркас, а затем остается нетронутым в течение 20 минут.

Затем все образцы осторожно перемещаются в инкубатор, устанавливают 5% углекислого газа и 37 градусов Цельсия и подвергают статическим или динамическим условиям в нерабочее время. По прошествии этого времени культивирования количество клеток, прикрепленных к каркасу, определяется с помощью анализа ДНК А для количественной оценки количества клеток в среде каркаса и фракциях колодца. В конечном счете, это достигается путем количественной оценки ДНК, присутствующей на скаффолде, лунке и в окружающей среде, для просмотра прикрепления клеток к скаффолдам используется сканирующая электронная микроскопия или СЭМ.

Идея этого исследования пришла нам в голову, когда мы узнали, что наши каркасы не покрывают все основание пластины колодца, а это означало, что существовала вероятность того, что не все элементы будут контактировать с каркасом и, следовательно, смогут прикрепиться. Для начала установите вставки для клеточных культур под потоком пластинки, открыв стерильные шестилуночные вставки для клеточных культур и отделив более короткие кольца с зубцами от более широких кольцевых тел. Затем возьмите кольцо зубьями, направленными вверх, и накиньте один из четырехсантиметровых скаффолдов на центр кольца, убедившись, что он перекрывается с обеих сторон.

Возьмите корпус с кольцом и расположите его над зубчатым кольцом и каркасом. Затем надавите вниз, убедившись, что каркас остается на месте и проходит через центр клеточной культуры. Вставка. Поместите вкладыш для клеточной культуры со скаффолдом в лунку шестилуночного планшета с низким связыванием и добавьте в каркас 10 миллилитров питательных сред.

Далее поместите политетрафторэтиленовые кормушки в отдельные чашки Петри и добавьте в кормушку 10 миллилитров питательных сред. С помощью щипцов задрапируйте один из трехсантиметровых каркасов в корыто, следя за тем, чтобы его длина лежала параллельно более длинному краю корыта. Чтобы настроить корпус биореактора под поток пластинки, необходимо подать 10 миллилитров стерильного фосфатного буферного раствора или PBS через главный порт корпуса биореактора.

Через 10 минут удалите PBS и замените восемью миллилитрами питательных сред с помощью щипцов. Вставьте один из трехсантиметровых лесов в судно через главный порт. Затем встаньте в сторону от главного порта.

После проведения подсчета мезенхимальных стволовых клеток человека, как описано в текстовом протоколе, отсасывайте среду из центрифужной трубки, покидающей клеточную гранулу, и замените ее рассчитанным объемом среды. Реактивная суспензия элементов и сред для равномерного смешивания. С помощью пипетки P 200 Gilson медленно дозируйте 200 микролитров клеточной суспензии в каждый каркас, проводя кончиком пипетки по длине каркаса и ниже поверхности жидкости среды.

Оставьте в покое на 20 минут, иначе из сосудов биореактора будет выдано 200 микролитров клеточной суспензии через главный порт. Долейте оставшиеся два миллилитра питательных сред через порты шприца, чтобы получить общий объем 10 миллилитров. Далее перенесите корпуса биореактора во вращающийся корпус биореактора и установите его на вращение.

При девяти об/мин перенесите луночные планшеты со вставками и впадинами для клеточных культур в шейкер и установите вращаться со скоростью 30 об/мин в инкубаторе с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислом газе или статической культуре. Перенесите луночные планшеты со вкладышами и кормушками для клеточных культур на полку инкубатора для клеточных культур. Установите при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Через четыре часа извлеките образцы из инкубатора и поместите под поток листовой пластинки. Затем удалите фракции среды из всех образцов и поместите их в отдельно маркированные центрифужные пробирки. После центрифугирования в течение пяти минут при 241 перегрузке удалите супинат перед добавлением трех миллилитров буферного вихря для лизиса, раствор для разрушения клеточной гранулы каркасов, удерживаемых внутри вставок клеточной культуры.

Затем с помощью щипцов снимите скаффолды и поместите в центрифужные пробирки, содержащие три миллилитра буфера для лизиса. Затем добавьте по три миллилитра буфера для лизиса в каждую емкость каркаса и соскребите поверхность. Снимите буфер для лизиса и поместите в пробирки для центрифуг с отдельной маркировкой.

Сделайте вихревой нагрузку на каждую центрифужную пробирку в течение примерно одной минуты, чтобы обеспечить достаточное перемешивание и стимулировать лизис клеточной мембраны. В черную 96-луночную пластину добавьте по 100 микролитров буфера для лизиса на каждый образец фракции каркасной среды, а затем в темноте добавьте 100 микролитров раствора клеточной ДНК во все лунки, содержащие лизис буфера и перемешайте. Осторожно включите лунки с буфером для лизиса, не содержащим ДНК, и раствором клеточной ДНК, чтобы обеспечить отрицательный и положительный контроль луночного планшета.

С помощью считывателя флуоресцентных пластин измерьте поглощение лунок при возбуждении 485 нм и излучении 520 нм. Сравните данные со стандартной кривой, сгенерированной на основе стандартов ДНК в соответствии с инструкциями производителя для выполнения фиксации СЭМ. После четырех часов инкубации извлеките все скаффолды из их емкостей и поместите в отдельные лунки новую шестилуночную пластину и пластинку потока.

Затем дважды промыть леса с ПБС до каждого. Ну и добавьте два миллилитра 1,5% глутаральдегида в PBS, чтобы обеспечить полное покрытие на скафоле. Оставьте пластину минимум на 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия для фиксации клетки.

Удалите фиксирующий раствор и дважды промойте леса PBS. Затем перенесите каркасы на новую луночную пластину для их обезвоживания с увеличением концентрации этанола в дистиллированной воде, начиная с 50% этанола, затем 70%, а затем 90% для каждой концентрации. Полностью погрузите каркасы в раствор и оставьте на три минуты, прежде чем выбросить раствор и повторить.

После обезвоживания скаффолдов в 100% этаноле путем полного погружения скаффолдов в раствор и оставления на пять минут, сбросить раствор и повторить химическую сушку скаффолдов. Использование HMDS в вытяжном шкафу. Погрузите леса в HMDS и оставьте на пять минут, прежде чем снять HMDS после однократного повторения.

Снимите HMDS и дайте подмосткам высохнуть. Затем установите каркасы на коммерчески доступные заглушки SEM, чтобы облегчить обзор внутри слоя SEM, образцы с золотым слоем в течение двух минут, чтобы обеспечить тонкое и равномерное покрытие. Наконец, поместите образцы внутрь СЭМ и визуализируйте сидячие каркасы с помощью электронного пучка пятикилограммового электронного хранилища.

Результаты показывают расположение клеток через четыре часа после посева для каждой исследованной экспериментальной установки. На этом рисунке показан процент ячеек, которые прикрепились к поверхности каркаса в течение этого времени, когда были исследованы все установки посева. Процент прикрепления клеток относительно низок, но наибольшая адгезия клеток у скаффолдов содержится во вставках клеточных культур и встряхивается при 30 об/мин.

Самая низкая адгезия была у скаффолдов, содержащихся внутри вставок клеточных культур и хранящихся в статических условиях. Большое количество клеток присутствовало во фракции среды, особенно для клеточной культуры. Вставки, удерживаемые в пластинах с низким связыванием при 50% и вращающихся сосудах при 51%.

48% для встряхивателя желоба и 50% для статического сканирования желоба. Электромикроскопия позволила визуально оценить засеянные клетками каркасы. Репрезентативные изображения показали ограниченное присутствие клеток на волокнистой поверхности независимо от настройки посева.

Тем не менее, большее количество клеток и клеточных агломератов присутствовало на скаффолдах, удерживаемых внутри вставок клеточных культур и встряхиваемых при 30 RP M. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, что засеивание известного количества клеток не обязательно приравнивается к такому количеству клеток, фактически прикрепляющихся к скаффолду, особенно для скаффолдов, которые не покрывают все основание диких пластин. Для таких скаффолдов рекомендуется сначала оптимизировать различные конфигурации засева ячеек, чтобы максимизировать первоначальное прикрепление ячеек к скаффолду.