Быстрая и надежная Анализ клеточной и молекулярной поляризации, индуцированной хемокинового сигнализации

Целью данной процедуры является быстрая и автоматическая количественная оценка изменений в морфологии клеток и субклеточной локализации специфических белков, представляющих интерес, в большом числе клеток в ответ на определенный стимул. Это достигается путем стимуляции Т-клеток с помощью представляющих интерес видов химиотерапии. На втором этапе клетки флуоресцентно мечаются, а затем анализируются с помощью проточной цитометрии.

На заключительном этапе количество морфологически поляризованных лимфоцитов и степень сегрегации флуоресцентных маркеров могут быть оценены на основе расположения и интенсивности пикселей для каждого окрашивания, в зависимости от выбранной маски. В конечном счете, эта технология проточной цитометрии может быть использована для быстрой и надежной количественной оценки морфологических изменений лимфоцитов после стимуляции хемокинами, а также расположения конкретных белков, представляющих интерес, в поляризованных клетках. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как микроскопия, заключается в том, что большое количество клеток может быть многократно обработано и автоматически проанализировано, что обеспечивает статистически сильный анализ морфологических изменений и распределения белков.

В Т-лимфоцитах, стимулированных хемокином, стимуляция Т-клеток по методу Бош начинается с пятикратной промывки центра пяти клеток в экспериментальных условиях в теплой центрифуге HBSS с добавлением 10 миллимолярных HEP-центрифуг в течение пяти минут при 340 G.At комнатной температуры, удалении супината и повторной суспензии гранул в 0,3 миллилитрах теплого HBSS ге штуки на пробирку. Затем перенесите клеточные суспензии в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Добавьте от 10 до 500 нанограммов на миллилитр хемокина в каждую пробирку, а затем переверните пробирки несколько раз, чтобы перемешать.

Инкубируйте клетки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Через восемь-10 минут остановите поляризацию с помощью 0,3 миллилитров теплого 2%-ного паральдегида с добавлением 10 миллимоляров. Он горох.

Затем смешайте пробирки с большим количеством переворачивания и инкубируйте их еще пять минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы окрашивать клетки для иммунофлуоресцентного анализа. Далее перенесите стимулированные Т-клетки в соответствующие пробирки проточной цитометрии. Полностью заполните пробирки буфером для окрашивания.

Затем раскрутите клетки и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах 5% эмбриональной сыворотки теленка в PBS. Теперь добавьте по пять микролитров ZI N-T-H-L-A-A-B-C в каждую трубку. Сделайте их вихревыми и инкубируйте клетки в течение 30 минут комнатной температуры в темноте в конце инкубации.

Промойте клетки дважды, а затем инкубируйте их в 500 микролитрах 1%-ного параформальдегида. Через 10 минут промойте ячейки в буфере для окрашивания, а затем полностью заполните пробирки буфером для проникновения. После промывки клеток дважды в проникающий буфер выходят пробирки для удаления супината, а затем вихревыми ими для диссоциации клеточных гранул.

Теперь окрашиваем образцы нолью целых 25 микрограмм на миллилитр, трикси для корейки, делаем их вихревыми и выдерживаем 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем в конце инкубационного периода промойте клетки в проникающем буфере. Опять же, resus.

Суспензируйте гранулы в 200 микролитрах PBS, а затем перенесите клетки в отдельные микроцентрифужные пробирки, чтобы определить процент поляризованных Т-клеток после стимуляции хемокинов. Сначала включите проточный цитометр и дайте ему откалиброваться в соответствии с инструкциями производителя. Построение гистограмм, которые количественно определяют значения среднеквадратичного градиента из популяции в фокусе, выбранной для среднеквадратичного градиента.

Гистограмма очерчивает популяцию отдельных клеток на гистограмме области после того, как микроцентрифужная трубка была вставлена в машину, регулирует мощность лазера на отдельных клетках и получает 5000 Тл-лимфоцитов. В программном обеспечении для анализа идей. Откройте полученные файлы, затем создайте гистограмму, показывающую среднеквадратичное значение градиента для изображений светлого поля, полученных для каждой отдельной ячейки, нарисовав на ячейках вентиль, показывающий среднеквадратичное значение градиента выше 57.

В меню анализа создайте новую маску с именем erode M1 two от морфологической маски на изображениях светлого поля M zero one, размытой на два пикселя. Затем в меню функций анализа создайте новый признак площади, рассчитанной по эрозии M1 через две маски из ячеек, созданных в предыдущем вентиле. Откройте гистограмму, показывающую площадь клеток Используя эту только что созданную маску, нарисуйте вентиль на отдельных Т-клетках, исключив калибровочные бусины и мусор на небольшой площади, а также дублеты на большой площади.

Затем откройте а. бот, состоящий из необработанного максимума на H-L-A-A-B-C окрашивание как функция необработанного максимума пикселя на Фин окрашивания в меню анализа масок сзади на новую маску под названием erode M два два от морфологии маски H-L-A-A-B-C окрашивания ячеек, размытых на два пикселя. Затем в меню функций анализа создаем новую характеристику, состоящую из параметра круговости, рассчитанного на эрозию M two two.

Затем создайте еще одну гистограмму для получения значений функции круговости из ранее закрытых ячеек. Затем, глядя на форму гистограммы для нестимулированных клеток, агата обратного осмоса для поляризованных клеток, начиная с самого низкого значения круговости до предельного значения круговости, где большинство нестимулированных клеток строятся на график для оценки поляризации окрашивания актина в клетках. Плюс гистограмма для яркого сходства деталей, значение R три для сравнения H-L-A-A-B-C и foid при окрашивании.

Затем используется та же стратегия гейтирования, что и только что продемонстрированная, плюс ГА на нестимулированных клетках для неко-локализованного сегрегированного окрашивания. На статистической панели показан процент Т-клеток с окрашиванием поляризованным актином. Приведены примеры стимулированных CCL 19 Т-лимфоцитов, которые попадают в ворота неполяризованных или поляризованных клеток.

Различия в морфологии между обеими субпопуляциями можно отчетливо наблюдать. Только что продемонстрированная стратегия стробирования может быть также использована для построения графика процента клеток, попадающих в поляризованный вентиль в отсутствие CCL 19. Как и ожидалось, очевидно, что стимуляция хемокинов увеличивает процент поляризованных Т-клеток.

Также можно построить средний индекс круговой формы для всей популяции клеток, полученный при обоих условиях. Действительно, стимуляция CCL 19 вызывает снижение этого показателя. Однако, поскольку только половина клеток поляризована, изменение среднего индекса круговой активности, наблюдаемое при стимуляции CCL 19, невелико.

В этом эксперименте Т-клетки были пересечены с помощью GFP вместе с плазмидами, кодирующими доминантные негативные мутанты комплекса полярности пар шесть. ПКЦ зета. Гистограмма для нетрансфицированных клеток позволила провести специфическое стробирование для соответствующих GFP-положительных Т-клеток, что указывает на то, что была трансфицирована небольшая часть всей клеточной популяции.

Степень морфологической поляризации этих трансфицированных клеток затем количественно оценивали путем измерения только индекса круговой активности GFP-положительных клеток и дополнительной походки для Т-клеток. Демонстрация низких значений круговой формы была создана для оценки процента поляризованных клеток при каждом взятом условии. В совокупности эти данные демонстрируют, что нарушение функции par six PK CZ к сигнальному пути ингибирует поляризацию Т-клеток, индуцированную хемокинами CCL 19 и c Xcl 12.

В соответствии с предыдущими выводами. При проведении этой процедуры очень важно всегда работать при температуре 37 градусов Цельсия на протяжении всего этапа стимуляции растворения и последующей фиксации, чтобы обеспечить сильную и надежную морфологическую поляризацию лимфоцитов.