Neural трансплантации стволовых клеток в экспериментальной Contusive модели с повреждением спинного мозга

Общая цель этой процедуры — подробно описать модель контузии при повреждении спинного мозга у мышей с последующей трансплантацией нейральных стволовых клеток. Это достигается путем посмертного мечения посмертных клеток-предшественников нейронных предшественников или NPC PM с помощью жизненно важного индикатора PKH 26. Далее на мыши делается дорсальный разрез и обнажается спинной мозг.

Затем с помощью ударного устройства с бесконечным горизонтом или IH создается поражение на спинном мозге. Наконец, меченые PKH 26 PM и PCs вводят в хвостовую вену мыши. В конечном счете, прослеживается судьба привитых ПЧН 20 в 18:00 и ПК в месте поражения.

Модель травмы повторяет травму спинного мозга человека. За первичной механической травмой следует прогрессирующая вторичная дегенерация, в которой изучается клеточное и фармакологическое лечение. Описанные приложения могут послужить методологической основой для дальнейшего понимания веры.

Индукция стволовых клеток, трансплантированных в спинной мозг, во время дегенерации и воспалительных процессов. Демонстрировать поражение будет доктор Тони Лайя Лонго, аспирант в лаборатории. В то время как инъекция хвоста будет выполняться доктором Аче, который является постдокторантом лаборатории, начиная с нейральных стволовых клеток, которые соответствуют критериям, описанным в текстовом протоколе.

Резус суспендирует клетки до концентрации от одного до 10 до шести клеток на 150 микролитров. Подготовьте не менее 1,2 умножить на 10 до шести клеток на каждую мышь, чтобы было достаточно клеток для загрузки пипетки. С помощью среды для нейральных стволовых клеток промойте клетки три раза в коническом флаконе объемом 10 миллилитров, вращая при температуре 500 раз больше G в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки.

После каждой промывки, перед окончательным подсчетом отжима, клетки затем после вращения аспирируют надосадочную жидкость, оставляя около 25 микролитров жидкости для предотвращения аспирации каких-либо клеток. Затем приготовьте суспензию с двумя Х-хромоспензиями, добавив один миллилитр разбавителя С в небо клеток, и используйте щадящее пипетирование для немедленной ресуспендии. Перед окрашиванием приготовьте два раствора красителя в разбавителе С, добавив четыре микролитра раствора этанола PKH 26 D к одному миллилитру разбавителя С в пробирке и хорошо перемешайте.

Для быстрого диспергирования добавьте один миллилитр двухклеточной суспензии в один миллилитр двух растворов XD и немедленно перемешайте образец с помощью пипетирования. После инкубации суспензии клеточной матрицы в течение одной-пяти минут прекратите окрашивание, добавив равный объем 1%-ного раствора БСА в HBSS, и инкубируйте в течение одной минуты. Затем центрифугируйте клетки при 500-кратном G в течение 10 минут и осторожно удалите надосадочную жидкость.

Используйте 10 миллилитров готовой среды для ресуспендирования клеточной гранулы для оценки восстановления клеток, жизнеспособности клеток и интенсивности флуоресценции. Центрифугируйте клетки, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 10 миллилитров HBSS в клеточную гранулу. Дважды промойте HBSS и повторно суспендируйте клетки в стерильном физиологическом растворе.

После подготовки операционного участка и мыши согласно текстовому протоколу поместите животное спинной стороной вверх на предметную грелку во избежание переохлаждения во время операции скальпелем, сделайте вертикальный разрез над интересующей областью от Т 7 до Т 12 с помощью щипцов. Подержите под стереомикроскопом кожу и поверхностный жировой пакет, обнаруженный между пятым и шестым грудными отростками. Считайте отросток под кровеносным сосудом как Т шесть, затем перейдите к Т семь.

Затем поместите небольшой подшипник под брюшную сторону мыши, чтобы увеличить кривизну позвоночника, и используйте щипцы для блокировки позвоночника, чтобы обездвижить его. Затем с помощью скальпеля разрежьте паралитературу позвоночных мышц с обеих сторон от Т 7 до Т 10 на уровне позвонков до тех пор, пока дорсальная поверхность пластинки не соприкоснется с кончиком скальпеля. Затем с помощью скальпеля отметьте место соединения от Т 7 до Т 10 на уровне позвонков до тех пор, пока дорсальная поверхность пластинки не соприкоснется с кончиком скальпеля в пространстве между Т 8 и Т 9 крошечными выступами.

Затем с помощью микроножниц разрежьте ткань между Т 8 и Т 9 и Т 9 и Т 9 и Т 10. Теперь с помощью rongeur удалите отросток T nine. Обнажите место соединения с помощью микроножниц, чтобы аккуратно соскоблить мышечный слой.

Продолжайте до тех пор, пока кость не обнажится. С помощью щипцов удалите мышцы из пластинки и откройте небольшое пространство между позвонками. Затем аккуратно введите микроножницы под кость.

Разрежьте пластинку с двух сторон и с помощью щипцов удалите ее, обнажив шнур. Используйте рон жур, чтобы удалить все оставшиеся свободные или зазубренные фрагменты костей. Затем удалите верхнюю половину спинного отростка T nine.

После выполнения протокола ударного устройства IH, в соответствии с рекомендациями в тексте, используйте четыре рассасывающихся шва для закрытия разреза, сначала накрыв открытый спинной мозг в месте удаленной пластинки. Следите за тем, чтобы не защемить нижележащие мышцы. Используйте два или три рефлекторных зажима, чтобы закрыть кожу.

Введите два миллилитра физиологического раствора в поясницу подкожно и поместите мышь в предварительно согретую клетку на грелку для восстановления. Для проведения инъекции клеток в хвостовую вену необходимо провести введение. Повторно суспендируйте клетки в пробирке и загрузите 75 микролитров в шприц объемом 0,3 миллилитра, следя за тем, чтобы в клеточной суспензии не присутствовали пузырьки.

Чтобы избежать оседания клеток, держите шприц в горизонтальном положении. Поместите мышь под тепловую лампу, чтобы расширить вены хвоста. Затем осторожно втяните мышь в ограничитель, чтобы визуализировать боковую хвостовую вену, которая выглядит как узкая синяя линия.

Используйте спиртовой тампон, чтобы очистить хвост, и как только вена будет визуализирована, захватите хвостовую вену между средним и большим пальцами левой руки. Ушиб Т-9, продемонстрированный на этом видео, вызвал временную потерю функции задней конечности трижды по 10 до пятой клетки, или PBS были введены в хвостовую вену за три инъекции, проведенные через 30 минут, шесть часов и 18 часов после травмы. Как показано здесь, в течение двух-трех недель PBS лечил травмированных, у мышей улучшилось, а функция задних конечностей достигла трех пунктов от базального мышиного масштаба или BMS мышей, получавших PM. Тем не менее, NPC показали более высокое восстановление и достигли 4,5 баллов BMS, как видно здесь, большинство прижившихся PM NPC, меченных PKH 26, накапливались по краям поражения, образуя кластеры.

Вскоре после введения трансплантированные клетки мигрировали по краям поражения и более диффузным образом, где они дифференцировались в нейроны. Через 30 дней после поражения и трансплантации клеточное тело PM NPC увеличилось в размерах, и в большинстве клеток дендритные процессы были очевидны и полностью иммуноокрашены специфическими антителами для картирования. Таким образом, мы предлагаем использовать нашу парадигму парадигмы поражения, за которой следует более воспроизводимый процесс восстановления.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить воспроизводимую экспериментальную модель травматического повреждения спинного мозга у мыши с помощью импактора с бесконечным горизонтом.