Использование остановил поток флуоресценции и меченых нуклеотидов для анализа АТФ Оборот Цикл кинезинов

Общая цель этой процедуры заключается в измерении кинетики связывания и диссоциации нуклеотидов во время цикла оборота кинезина A TP. Это достигается путем предварительного получения белка кинезина, либо свободного от нуклеотидов, либо загруженного флуоресцентно меченным нуклеотидом. Далее полученный кинезин смешивают с нуклеотидом с помощью флуориметра с остановленным потоком и наблюдают изменение флуоресценции, связанное со связыванием или диссоциацией флуоресцентно меченного нуклеотида.

Затем изменение флуоресценции подгоняется под экспоненциальную функцию для получения константы скорости. Наконец, измеренные константы скорости передаются, а константы скорости приписываются конкретным переходам цикла оборота A TP. В конечном счете, комбинация флуоресцентно меченного нуклеотида и флуоресценции остановленного потока используется для измерения кинетики связывания и диссоциации нуклеотидов.

ЦИН: Демонстрировать процедуру будут Дженнифер Патель, постдок и Ханна Белч, аспирантка из моей лаборатории. После определения интенсивности флуоресценции кинезина при связывании меченого человеком нуклеотида, как указано в текстовом протоколе, с раствором до 20 микромолярных кинезинов в свободном буфере магния при одном миллимоляре ЭДТА и одном миллимольяре DTT инкубируют раствор в течение 15 минут при 25 градусах Цельсия, устанавливают гелевую фильтрационную колонну с гравитационным потоком G 25 SX и уравновешивают не менее чем тремя объемами колонки без магния. буфер. Затем загрузите раствор эссина в колонку, чтобы отделить свободные нуклеотиды и ЭДТА от кинезина.

Отремонтируйте коллекторную трубку, добавив в пустую пробирку объем 100 миллимолярного раствора хлорида магния таким образом, чтобы конечная концентрация хлорида магния составляла один миллимоляр. После сбора раствора кинезина, используя соответствующий буфер без магния, быстро вымывают кинезин. Наличие хлорида магния в пробирке для сбора помогает стабилизировать кинезин сразу после того, как Ян из колонки хранит кинезин на льду и использует в течение одного-двух часов.

Тем временем подготовьте мужчине серию концентраций ТП. Выбирайте диапазон концентраций в соответствии с доступной концентрацией кинезина. Для каждой концентрации манта ТП готовят подходящую концентрацию кинезина таким образом, чтобы меченый человеком нуклеотид находился в 5-10-кратном молярном избытке по сравнению с сайтами связывания нуклеотидов кинезина.

Установите длину волны возбуждения на флуориметре остановленного потока 365 нанометров и длину волны излучения выше 400 нанометров с помощью фильтра длинных частот. Затем, начиная с самой низкой концентрации ТП манты, используйте флуориметр с остановленным потоком, чтобы смешать ТП манта и безнуклеотидные кинезины в соотношении объем к объему один к одному. Использование следующей формулы подогнала меру интенсивности флуоресценции, чтобы обучить концентрацию манта A TP экспоненциальной функции, плюс линию постоянного отрицательного наклона для учета фотообесцвечивания мантовой группы.

Из этих подгонок определяют константу скорости при каждой концентрации манта. Затем ТП делегирует скорости ассоциации и диссоциации путем нагнетания зубной нити против концентрации манта. Затем TP подгоняет эти данные к линейной функции, чтобы получить градиент и пересечение оси y.

Градиент представляет собой константу скорости для человека, ассоциацию TP с единицами на моляр в секунду. Пересечение представляет собой константу скорости диссоциации с единицами в секунду. Чтобы измерить константу скорости диссоциации, ферментируйте DP до раствора двух микромолярных кинезинов в подходящем буфере при 50.

Микромоляр означал инкубатор DP при температуре 25 градусов Цельсия в течение 30 минут. После использования колонки G 25 Sedex для удаления хромоты, A DP из кинезина, загруженного мантом A DP, и настройки флейтера стоп-потока, как описано ранее в этом видео, используйте остановленный поток для смешивания комплекса манта A DP Kinine с 50-кратным или более молярным избытком немеченого A TP в соотношении объема к объему один к одному. Уменьшение интенсивности флуоресценции, наблюдаемое с течением времени, до одной экспоненциальной функции, плюс линия постоянного отрицательного наклона, позволяющая производить фотообесцвечивание группы.

Копс, определенный из этого подгонки, является константой скорости для диссоциации мантовой области A DP с единицами измерения в секунду. Величина изменения сигнала при связывании или диссоциации нуклеотида древесины Мантлея зависит от конкретного кинезина. Поэтому полезно сначала выполнить измерения равновесия, чтобы подтвердить как наличие, так и величину изменения интенсивности флуоресценции.

Здесь показаны флуоресцентные спектры ферментации ТП и означающего ДП как в растворе, так и в комплексе кинезина М КСА. На этом рисунке изображена реакция, происходящая при смешивании ТП человека с кинезином, свободным от нуклеотидов. Показано увеличение интенсивности флуоресценции, происходящее при связывании человека A TP с M CAC, что соответствует зависимости скорости от человека.

Концентрация TP в линейной функции, как показано здесь, позволяет деконволюционизировать константу скорости, которая вносит вклад в kops, и обеспечивает ассоциацию и диссоциацию скорости фермента A TP. На этом рисунке показано наблюдаемое снижение интенсивности флуоресценции фермента A DP при диссоциации с M CEC, как показано здесь. Константа скорости диссоциации mant A DP от кинезина определяется путем подгонки этих данных к экспоненциальной функции. После освоения каждый из этих протоколов может быть завершен менее чем за три часа.

Хотя этот метод может дать представление о кинезине, он также может быть применен к другим нуклеотид-связывающим белкам, таким как миозин и G-белки. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать флуоресцентно меченные нуклеотиды и стоп-флоуметр для измерения кинетики связывания и диссоциации нуклеотидов для кинезина.