Региоселективный Biolistic Ориентация в Органотипической мозга Ломтики Использование модифицированного гена Gun

Целью этой процедуры является быстрая и эффективная трансфекция или маркировка отдельных областей органотипических срезов с помощью генной пушки. Это достигается путем предварительного приготовления жизнеспособных органотипических срезов мозга или других тканей. Второй шаг — производство ДНК или расшифрованных частиц золота для биотической доставки.

Затем органотипический срез помещают под стабилизированную генную пушку, и покрытые ею частицы выстреливают в ткань или эписомальную трансформацию или мечение. Заключительным этапом является наблюдение или анализ влияния гетерологичных генов, доставляемых в изолированные области. В конечном счете, этот подход позволяет пользователю точно трансфицировать отдельные области срезов органа различными гетерологичными генами.

Основным преимуществом этого метода перед существующими методами является то, что биологистика позволяет трансфектировать терминально дифференцированные клетки, а также ограничивать радиус действия небольшим диаметром. Этот метод может помочь понять ключевые нейробиологические вопросы, такие как понимание регионального вклада одного гена. Начните эту процедуру с помещения свежего мозга в небольшую форму для реципиента.

Покройте его раствором ARO, который был вызван до температуры чуть выше комнатной. Затем быстро охладите форму до четырех градусов Цельсия, поместив ее на лед. Когда арос застынет.

Через пять-10 минут извлеките залитый мозг из формы. После этого приклейте его к платформе фиброслайсера. Затем перенесите платформу в камеру для слайсера Vibra, содержащую стерильный ледяной PBS.

После нарезки аккуратно поместите срезы на вкладыши для клеточных культур в шестилуночный лоток с питательной средой на внешней стороне вкладыша. Инкубируйте их во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. В этой процедуре приготовьте наноснаряды с использованием частиц золота диаметром 40 нанометров, сначала добавив 50 микролитров 0,05 моляра сперматозоида и 10 микролитров ДНК из расчета один миллиграмм на миллилитр до 10 миллиграммов частиц золота.

Затем добавьте хлорид кальция в смесь раствора, чтобы помочь связыванию молекул ДНК с наночастицами золота. После этого наберите раствор в трубку с помощью шприца. Поместите трубку в станцию подготовки трубок.

Дайте золотым частицам осесть. Затем снять супинат методом аспирации с помощью шприца. Вращайте трубку, чтобы равномерно распределить золотые частицы.

Впоследствии высушите частицы при постоянном потоке азота со скоростью пять литров в минуту. Чтобы создать ДНК-пули, разрежьте трубку на кусочки размером в один сантиметр с помощью резака для трубок. Затем либо вставьте их сразу в картридж, выращенный с помощью гена, либо держите их при высыхании при температуре четыре градуса Цельсия до использования в стерильном колпаке для протекания пластинки, загрузите картридж, содержащий золото, покрытое ДНК, в держатель картриджа.

Затем загрузите держатель в генную пушку. Прикрепите к нему модифицированный генный ствол пистолета с помощью стерильных щипцов. Поместите фильтрующий вкладыш, содержащий органотипический ломтик, в стерильную пластиковую посуду.

Извлеките носитель из органотипического среза. Далее установите давление газа на уровне 50 PSI с помощью крепления. Поместите генную пушку на расстоянии 10 миллиметров над желаемой областью среза для генетической доставки.

Затем тщательно прицельтесь в центр ствола и выстрелите покрытыми частицами в ткань. После биотической трансфекции дважды аккуратно промойте ломтик PBS. Затем зафиксируйте ломтик, инкубируя в 4% ледяной PFA в PBS в течение 20 минут.

После этого промойте ломтик дважды в PBS. Опять же, аккуратно отрежьте мембрану от вставки с помощью скальпеля, не потревожив срез. Затем поместите мембранную опору на предметное стекло микроскопа с щипцами и дайте органотипическому срезу покоиться на ней.

Далее добавьте одну каплю монтажного носителя на срез. Аккуратно положите чехол без какого-либо усилия, непосредственно соприкасаясь с тканью. После этого закрепите чехол листом тонким слоем лака для ногтей.

На этом рисунке показана биотическая доставка ДНК, кодируемой флуоресцентным белком, в органотипический срез шестинедельной мыши. Как можно видеть здесь, нейрон бикини с замечательной дендритной гаванью, обнаруженный на границе слоя бикини и молекулярного слоя мозжечка, демонстрирует выраженную маркировку после транзиторной биотической трансфекции с помощью P-E-G-F-P-N one. Здесь находится большее увеличение дендритов с шипами, а вот параметаллическая ячейка, обнаруженная примерно в одной области гиппокампа.

После биотической доставки наночастиц золота с покрытием PDS Red FP После освоения эта техника может быть выполнена всего за несколько часов в течение трех-четырех дней после этой процедуры. Другие методы, такие как конфокальная микроскопия, могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, например, как определенные нейроны связаны с соседними областями.