Автоматизация чип-след эксперименты для генерации эпигенетические профили на 10000 клеток HeLa
10 декабря 2014 г.
Методы картирования взаимодействия белка и ДНК in vivo становятся критически важными для каждого аспекта геномных исследований, но они трудоемки, дорогостоящи и отнимают много времени. Здесь представлена коммерчески доступная роботизированная система работы с жидкостями, которая автоматизирует иммунопреципитацию хроматина для картирования взаимодействий белка и ДНК in vivo с ограниченным количеством клеток.
Общая цель этой процедуры — предоставить исследователям автоматизированную платформу, способную проводить эксперименты по иммунопреципитации хроматина всего на 10 000 клеток. Это достигается путем предварительного приготовления высококачественного сдвигового хроматина для иммунопреципитации хроматина. На втором этапе создается автоматизированный эксперимент по иммунопреципитации хроматина и запускаются автоматизированные библиотеки с иммунопреципитированной ДНК.
Иммунопреципитированная ДНК анализируется с помощью количественной ПЦР и секвенирования нового поколения. В конечном счете, успех автоматизированной технологии может быть подтвержден путем сравнения профилей иммунопреципитации хроматина, сгенерированных на исходном образце из 10 000 клеток, с экспериментами, проведенными на 100 000 клеток, и существующими наборами данных для справки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики и углубить наше понимание функций специфических биомаркеров в различных тканях.
Стадии развития и состояния болезни. Этот метод имеет значение для диагностики нескольких заболеваний, поскольку он поможет определить эпигенетические биомаркеры в здоровье и болезни, точные и надежные. Автоматические технологии являются важными инструментами для исследователей в эпигенетическом анализе конкретных типов клеток, субпопуляций и биопсий.
Для стандартного автоматизированного эксперимента по иммунопреципитации хроматина начните с добавления 120 микролитров буфера иммунопреципитации хроматина H к 100 микролитрам срезанного хроматина от одной до 2 миллионов клеток, зарезервировав от 2 до 20 микролитров хроматина для входного образца. Затем для настройки автоматизированного эксперимента на IP star compact выберите протоколы и нажмите на иконку иммунопреципитации хроматина. Выберите прямой метод иммунопреципитации хроматина, а затем на следующем экране выберите протокол иммунопреципитации хроматина 200 мкл и укажите номер образца.
Установите экспериментальные параметры иммунопреципитации хроматина на четыре часа для покрытия антител. Шаг 15 часов для этапа иммунопреципитации, и пять минут для каждого этапа мытья. Затем настройте реагенты в соответствии с инструкциями, отображаемыми на экране с информацией о макете, и добавьте соответствующие реагенты и антитела класса ChIP-seq с высокой степенью валидации.
Затем добавьте 20 микролитров белка, магнитные шарики с покрытием А для каждой реакции, и образцы хроматина после того, как протокол ночного чипа и обратное сшивание закончатся. Очистите ДНК с помощью набора для очистки ДНК на основе магнитных шариков. Используйте высокочувствительный коммерческий флюорометрический анализ для количественного определения иммунопреципитированной ДНК.
Затем используйте праймеры по крайней мере для одной положительной и одной отрицательной контрольной области генома. Проанализировать качество иммунопреципитированной ДНК методом количественной ПЦР в соответствии с соответствующими параметрами материалов для анализа. Результаты выражаются в процентах восстановления входных данных для секвенирования следующего поколения в соответствии с протоколами.
Теперь нажмите на значок подготовки библиотеки, затем выберите предпочитаемую технологию подготовки библиотеки и настройте реагенты в соответствии с инструкциями на экране с информацией о макете. Например, в этом эксперименте были сгенерированы профили секвенирования для шести различных модификаций гистонов, связанных с экспрессией генов. Наблюдаемая высокая пиковая корреляция между этими маркерами гистонов указывает на способность автоматизированной системы генерировать точные и надежные данные.
Более того, эти графики показывают распределение пиков для различных модификаций гистонов в конкретных областях генома. Наконец, для автоматизированного эксперимента по иммунопреципитации хроматина для образцов с низким числом клеток установите протокол автоматического иммунопреципитации хроматина 200 микролитров в системе автоматизации, как показано выше. Затем загрузите в систему ChIP-seq, классифицируйте антитела и реагенты, оптимизируйте для работы с количеством хроматина от 10 000 до 100 000 клеток, используя всего 10 микролитров белка, покрытых магнитными шариками для каждой реакции.
После чипа запустите подготовку библиотеки, выберите протокол подготовки библиотеки микроплекса и настройте реагенты, следуя инструкциям, отображаемым на экране с информацией о макете. В этой репрезентативной количественной ПЦР иммунопреципитации хроматина из исходного образца из 10 000 клеток наблюдалось значительное обогащение антигистонными антителами в положительных контрольных областях и незначительные сигналы в отрицательных контрольных областях. Здесь показана серия из 10 реакций иммунопреципитации, которые были воспроизводимы и в значительной степени сопоставимы с ручным экспериментом по иммунопреципитации хроматина, демонстрируя способность автоматизированной системы работать с малыми количествами клеток без видимого увеличения вариабельности эксперимента в эксперименте по сравнению с ручной иммунопреципитацией.
Эти данные иллюстрируют биоинформатический анализ библиотек последовательностей 10 000 и 100 000. S3-клетки после иммунопреципитации хроматина, демонстрируя выдающиеся результаты из образцов иммунопреципитации хроматина с низким числом клеток. Этот набор данных, который соответствует эксперименту с 10 000 клеток исходного материала, содержит низкий фоновый шум с высоконадежными пиками обогащения, которые подтверждены как набором данных из 100 000 клеток, так и справочным набором данных Института Броуда.
Для проекта encode важно отметить, что данные 10 000 ячеек демонстрируют почти идентичные пикам данных Института Броуда с 98%-ным коэффициентом перекрытия лучших 40%-ных пиков, ранжированных по значимой оценке, используемой в проекте конечного кода. Автоматизированная система IP star требует минимального вмешательства оператора, что сокращает время HandsOn для иммунопреципитации хроматина до одного-двух часов. Кроме того, автоматизированный процесс заменяет многочисленные подверженные ошибкам этапы ручного иммунопреципитации хроматина и обеспечивает стабильные результаты.
При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что хорошая иммунопреципитация хроматина и хороший выбор высокоспецифичных и чувствительных антител являются ключом к успеху эксперимента. Эта технология проложила путь для исследователей во всех областях биологии к повышению точности, воспроизводимости и последовательности терапии. Эпигенетические исследования.
Обзор
В данной статье представлена автоматизированная платформа для иммунопреципитации хроматина (ChIP), которая позволяет эффективно обрабатывать малые количества клеток, в частности 10 000 клеток. Метод направлен на оптимизацию картирования белково-ДНК взаимодействий, что имеет принципиальное значение для геномных исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Геномика
- Эпигенетика
- Автоматизированные лабораторные методы
Теоретическая часть
- Взаимодействия белков с ДНК имеют решающее значение для понимания регуляции генов.
- Традиционные методы ChIP трудоемки и требуют большого количества клеток.
- Автоматизация может повысить эффективность и воспроизводимость геномных экспериментов.
- Данное исследование посвящено роботизированной системе, сводящей к минимуму ручное вмешательство.
Цель исследования
- Разработать автоматизированный метод ChIP для работы с малым количеством клеток.
- Подтвердить эффективность автоматизированной системы в сравнении с традиционными методами.
- Способствовать идентификации эпигенетических биомаркеров при состояниях здоровья и заболеваниях.
Используемые методы
- Подготовка высококачественного фрагментированного хроматина из 10 000 клеток.
- Автоматизация процесса ChIP с использованием роботизированной системы обработки жидкостей.
- Анализ иммунопреципитированной ДНК с помощью количественной ПЦР и секвенирования следующего поколения.
- Сравнение результатов с данными, полученными из более крупных образцов клеток и существующих наборов данных.
Основные результаты
- Автоматизированная система обеспечила получение надежных и воспроизводимых результатов, сопоставимых с данными, полученными при использовании ручных методов.
- В областях положительного контроля наблюдалось значительное обогащение модификациями гистонов.
- Высокая корреляция с эталонными наборами данных подтвердила точность автоматизированного подхода.
- Минимальное вмешательство оператора позволило существенно сократить время непосредственной работы.
Выводы
- Автоматизированный метод ChIP эффективен при малом количестве клеток.
- Данная технология может способствовать развитию эпигенетических исследований и поиску биомаркеров.
- Автоматизация повышает согласованность и надежность геномного анализа.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Автоматизация ChIP-seq для малого количества исходных клеток устраняет критическое узкое место в валидации эпигенетических мишеней, позволяя снизить риски при проверке механистических гипотез с использованием ограниченных популяций первичных или редких клеток. Эта возможность повышает точность прогнозов на ранних этапах поиска за счет получения воспроизводимых эпигеномных профилей из ограниченных образцов, что способствует приоритизации портфеля препаратов и принятию решений на основе биомаркеров. Данная технология превращает эпигеномные анализы в масштабируемые и многократно используемые инструменты поиска, обеспечивающие трансляционную преемственность от идентификации мишени до доклинической валидации.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы и уточнять сигнальные пути с помощью профилирования модификаций гистонов в образцах с низким содержанием исходного материала.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков и функциональной валидации мишеней путем получения воспроизводимых данных ChIP-seq из 10 000 клеток.
- Прогностическая ценность: облегчает приоритизацию портфеля проектов благодаря надежным эпигеномным показателям, которые коррелируют с эталонными наборами данных и результатами ручного контроля.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем создания стандартизированных и автоматизируемых рабочих процессов ChIP-seq.
- Практическая ценность: Решение вопросов стандартизации анализа, воспроизводимости и количественного получения данных с помощью автоматизации на основе магнитных частиц и считывания результатов методом qPCR/NGS.
- Масштабируемость: Обеспечение готовности к скринингу и возможности повторного использования платформы за счет сокращения времени ручного труда и минимального вмешательства оператора.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Обсуждается значимость для понимания заболеваний посредством идентификации эпигенетических биомаркеров в здоровом состоянии и при патологиях с использованием ChIP-seq на малом количестве клеток.
- Доклиническое соответствие: Описывается преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет обеспечения согласованного эпигеномного профилирования образцов различного размера.
- Продвижение с учетом рисков: Обоснование решений на основе воспроизводимых данных с низким уровнем фонового шума, подтвержденных с помощью наборов данных из 100,000 клеток и референсных наборов данных.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Автоматизированный метод ChIP-seq интегрируется в непрерывный процесс исследований — от проверки гипотез до идентификации перспективных мишеней, что позволяет проводить эпигеномное профилирование на ранних этапах при ограниченном количестве материала.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем создания профилей модификации гистонов при использовании малого количества клеток.
- Скрининг: гарантирует готовность и воспроизводимость анализа за счет автоматизированной подготовки библиотек и количественных показателей извлечения ДНК.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зависимых переменных с помощью qPCR (% извлеченного материала) и корреляции пиков NGS для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преклиническую преемственность за счет эпигеномных профилей, согласованных с биомаркерами и валидированных с помощью ортогональных наборов данных.
- Корпоративное повторное использование: представляет роботизированную платформу как многократно используемый ресурс для проведения эпигенетических анализов в различных проектах, что снижает избыточность.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности, валидация мишеней и снижение механистической неопределенности в исследованиях эпигенетических механизмов.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость, достигаемые за счет автоматизированного дозирования жидкостей и минимизации ручных операций.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах за счет получения надежных эпигеномных данных при низком количестве исходного материала.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков и обоснованные решения о продвижении проектов на основе воспроизводимых результатов ChIP-seq, коррелирующих с референсными данными.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке хроматина, валидации антител и работе с автоматизированными системами дозирования жидкостей.
- Необходимо наличие оборудования, включая роботизированную платформу (например, IP-Star Compact), систему работы с магнитными бусинами, а также инфраструктуру для анализа с помощью qPCR/NGS.
- Для обеспечения воспроизводимости необходима межкомандная стандартизация выбора антител, фрагментации хроматина и параметров протокола.
- При масштабировании с 10,000 до 100,000 клеток или при применении к первичным биопсиятам и субпопуляциям требуются соответствующие адаптации.
- Практические ограничения включают зависимость от высококачественных специфических антител и оптимальной фрагментации хроматина для успешного проведения анализа при малом количестве исходного материала.
