Вывод и характеристика Transgene-свободный человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток линии и превращение в определенных условиях Клинико-класса

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы получить лентивирусные репрограммированные бесфакторные индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки и преобразовать эти клетки в предполагаемые клинические условия. Это достигается путем предварительного перепрограммирования взрослых дермальных фибробластов человека с помощью одной увеличенной кассеты или стволовой тележки для стволовых клеток Ex-size в HI-PSCs. Затем перепрограммированные ПСК HI подвергаются воздействию вируса адено Cree purr для полного иссечения и удаления стволового автомобиля из генома хозяина.

Затем экстракция геномной ДНК из питающих свободных HI ПСК с последующим анализом агеля подтверждает правильность эксцизии стволового автомобиля. Наконец, ИПК с фактором три H преобразуются в предполагаемые условия содержания GMP с помощью медленной методологии преобразования в полностью определенные условия, свободные от ино. В конечном счете, вирусное перепрограммирование взрослых дермальных фибробластов человека и полная конверсия H IPC в клинические условия подчеркивает широкую применимость этой методологии для перепрограммирования взрослых клеток человека и преобразования их в клинически значимые условия.

Применение этого метода распространяется на клиническое применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, поскольку они полностью свободны от факторов и преобразуются в клинические условия, что делает их совместимыми с человеческими терапевтическими средствами. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку перепрограммирование, эксцизия и этапы клинической конверсии трудно изучить из-за основных сложных и специфических процедур, которые необходимо выполнить, чтобы получить фактор три и клинически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека. Взрослые кожные фибробласты человека или HAF в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут.

Будьте осторожны, чтобы не погрузить верхнюю часть флакона в воду. Поместите одну миллилилитровую суспензию клеток в 15-миллилитровый флакон для ресуспендирования клеток и разбавьте ДМСО по каплям. Медленно добавьте четыре миллилитра предварительно подогретой huff medium центрифугируйте в 200 раз больше г в течение 10 минут комнатной температуры.

Затем аспирируйте суп, нацент и реус. Суспендируйте клетки в концентрации от 100 000 клеток на миллилитр в одну лунку шестилуночного планшета до 0,2% желатина. Добавьте два миллилитра клеточной суспензии, затем добавьте два миллилитра суспензии на вторую.

Ну, для измерения кратности инфекции или MOI, раскачивать пластину из стороны в сторону и вперед и назад, чтобы равномерно распределить клетки перед их инкубацией в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в увлажненной камере. Через 24 часа после подсчета клетки оттаивают два раза, центрируют восемь единиц трансдукции или S эквивалентного концентрата лентивируса и разбавляют его до 10 раз До восьми ТЦ на миллилитр используют половинку среды с добавлением восьми микрограмм на миллилитр трансфекционного реагента. Трансдуцируют клетки в 10-кратном соотношении инфекции.

Равномерно перемешайте лунки и инкубируйте в течение ночи примерно через 24 часа после лентивирусной трансдукции. Удалите затяжную среду и замените ее стандартной средой для плюрипотентных стволовых клеток человека или средой для ПСХ. Ежедневно меняйте среду со второго по шестой день на две 0,2%-ную 10-сантиметровую тарелку с желатиновым покрытием от 1,5 до 1,75 умножить на 10 на шесть эмбриональных фибробластов мыши, полученных из фактора комплемента один или CF 1 на половину средней среды на седьмой день.

Добавьте отключения комнатной температуры в одну лунку из шести лунок перепрограммированных фибробластов. Она осторожно отрывает клетки и вращает в 100 раз больше G с помощью свежей человеческой средней пластины PSC все клетки в соотношении один к 16 на двух 10-сантиметровых метамфетаминовых пластинах CFI. Распределите агрегаты по спирали по часовой стрелке и инкубируйте в течение примерно 48 часов, прежде чем заменить среду.

Через три-четыре недели с помощью иглы 21 калибра отоберите от восьми до 10 отдельных фрагментов определенных колоний с типичной морфологией, подобной ESC, и субклонируйте их в отдельные лунки CFI MFS после расширения. Подтвердите плюрипотентность клеток путем формирования тела эмбриона и анализа экспрессии маркеров после проверки сайта интеграции стволового автомобиля, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Удалите стволовую машину, сначала отсасывая старую человеческую среду PSC до трех миллилитров стандартной среды PSC в совокупности.

45 микролитров концентрированного адено Cree pur или вируса с восемью микрограммами на миллилитр трансфекционных агентов. Затем добавьте в клетки и инкубируйте в течение 24 часов после инкубации, аспирируйте вирусный супинат, индуцируйте человеческую среду ПСК для промывания клеток дважды. Затем добавьте среду HPSC с двумя микрограммами на миллилитр чистого мицина и ежедневно подменяйте через пять дней, субклонируйте оставшиеся колонии и расширяйте их, как описано ранее в видео.

Затем разморозьте один флакон матрицы базальной мембраны pre Eloqua на льду и разбавьте холодную базальную среду до конечной концентрации от одного до 30. Используйте один миллилитр на лунку, чтобы покрыть желаемое количество лунок шестилуночной пластины, и дайте пластине постоять при комнатной температуре в течение одного часа. Затем с помощью иглы 18 калибра заштрихуйте не менее 20-30 колоний из лунки, предварительно покрытой me.

Позаботьтесь о том, чтобы уменьшить подъем и перенос клеток из пластины. После часовой инкубации отсасывайте матрицу из лунки с покрытием с помощью пипетки объемом 200 микролитров. Удалите кусочки колоний, аккуратно соскребая их со старой пластины, и осторожно поместите их в три миллилитра свежесмешанной среды, по одному в пластину с матричным покрытием.

После инкубации в течение 48 часов ежедневно меняйте среду, когда после удаления и без подачи преобразованные HI PSC достигнут 80% плавности. Используйте коммерческий набор для экстракции ДНК для извлечения геномной ДНК с использованием показанных здесь праймеров, специфичных для экзогенных интеграций стволового автомобильного лентивируса. Проанализируйте ДНК с помощью ПЦР для надлежащего иссечения для перехода постэксцизированных HI PSC в условия GMP.

Смесь HPSC комбинированная среда один и клинический класс GMP соответствует стандарту GMP или комбинированная среда два с соотношением предварительного нагрева от 80 до 20 до 37 градусов Цельсия. Отсадите из ячеек старую комбинированную среду и замените на три миллилитра нового раствора теплой среды. Заменяйте среду ежедневно в течение трех дней, проходя в соответствии с текстовым протоколом для поддержания надлежащего размера и плотности колонии на четвертый день, замените среду смесью 50 на 50 теплой комбинированной среды один и два инкубируйте в течение трех дней.

Заменив среду ежедневно на седьмой день, переключитесь на соотношение 20 на 80 подогретых комбинированных сред один и два соответственно и заменяйте ежедневно в течение трех дней. На 10 день переходим на теплый, 100% комбинированный средний два и меняем ежедневно. Теперь ячейки находятся в полностью определенной среде без ксено.

Затем, после использования определенного свободного ксенонескопического субстрата для покрытия одной лунки из шести луночных планшетов, замените свободную ксеносреду в лунке слияний ячеек свежей средой, содержащей одну x породу. После инкубации в течение одного часа с помощью иглы 18-го калибра механически превратите клетки в свежеприготовленные. Дайте клеткам спокойно инкубироваться в течение двух дней, чтобы обеспечить максимальное прикрепление, прежде чем характеризовать клетки в соответствии с текстовым протоколом.

На этом рисунке показана репрезентативная картина трех различных предварительно иссеченных линий H-I-P-S-C после перепрограммирования с использованием стволового подхода на слое MES, показанном здесь геле для ПЦР после эксцизионной обратной транскрипции, показывающем один конкретный субклон, полностью свободный от стволового автомобильного лентивируса, о чем свидетельствует отсутствие ампликонной полосы, специфичной для конкретной последовательности, эндогенной к стволовому автомобилю. На этом рисунке предварительно преобразованные ИПК на ксеносодержащей матрице и постакцизные ИПК GMP класса H на синтетической матрице показаны количественные показатели стандартных факторов, связанных с плюрипотентностью, включая SOX 2, OCT 4 и наног. Использование QPCR проиллюстрировано здесь.

Наконец, как видно на рисунке, пре-конконвертированные и пост-конвертированные HI ПСК в условия класса GMP были протестированы с помощью проточной цитометрии на наличие сиаловой кислоты и гликолевой нейронной кислоты, указывающих на антигены, отличные от человека. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как перепрограммировать дермальные фибробласты взрослого человека с помощью вируса перепрограммирования стволовой системы, вырезать вирус из генома, а затем полностью преобразовать эти HI-ПСК в клинические условия, полностью совместимые с человеческими методами лечения. Не забывайте, что работа с staca, противовирусным вектором третьего поколения, может быть крайне опасной и предосторожной.

При выполнении этой процедуры следует использовать надлежащие СИЗ и комнату для культивирования тканей VSL two plus.