Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Jason P. Awe; Agustin Vega-Crespo; James A. Byrne

doi:10.3791/52158

Вывод и характеристика Transgene-свободный человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток...

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Вывод и характеристика Transgene-свободный человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток линии и превращение в определенных условиях Клинико-класса

Full Text

8,301 Views

10:48 min

November 26, 2014

DOI: 10.3791/52158-v

Jason P. Awe¹, Agustin Vega-Crespo¹, James A. Byrne^1,2

¹Department of Molecular and Medical Pharmacology,University of California, Los Angeles (UCLA), ²Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research,University of California, Los Angeles (UCLA)

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article describes a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and converting them into putative clinical-grade conditions. The methodology emphasizes the reprogramming of adult dermal human fibroblasts and the subsequent conversion of hiPSCs into clinically relevant conditions.

Key Study Components

Area of Science

Stem cell biology
Cell reprogramming
Clinical applications of stem cells

Background

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are valuable for regenerative medicine.
Reprogramming adult cells can provide a source of patient-specific stem cells.
Factor-free reprogramming reduces the risk of genomic integration of foreign DNA.
Clinical-grade conditions are essential for therapeutic applications.

Purpose of Study

To develop a reliable protocol for generating hiPSCs from adult fibroblasts.
To ensure the removal of reprogramming factors from the host genome.
To convert hiPSCs into conditions suitable for clinical use.

Methods Used

Reprogramming adult dermal fibroblasts using a lentiviral stem cell cassette.
Exposing reprogrammed hiPSCs to adeno-Cre virus for excision of the stem cell cassette.
Genomic DNA extraction and analysis to confirm proper excision.
Conversion of hiPSCs into defined xeno-free conditions for clinical applications.

Main Results

Successful reprogramming of fibroblasts into hiPSCs.
Effective excision of the stem cell cassette from the genome.
Conversion of hiPSCs into putative GMP-grade conditions.
Demonstration of the methodology's broad applicability for clinical relevance.

Conclusions

The protocol provides a robust method for generating clinically relevant hiPSCs.
Factor-free reprogramming enhances safety for therapeutic applications.
This approach can be applied to various adult human cells for reprogramming.

Frequently Asked Questions

What are hiPSCs?

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are stem cells that can be generated directly from adult cells.

Why is factor-free reprogramming important?

Factor-free reprogramming minimizes the risk of genomic integration of foreign DNA, enhancing safety for clinical applications.

What is the significance of GMP-grade conditions?

GMP-grade conditions ensure that stem cells are produced in compliance with regulatory standards for clinical use.

How are adult fibroblasts reprogrammed?

Adult fibroblasts are reprogrammed using a lentiviral stem cell cassette that introduces pluripotency factors.

What role does the adeno-Cre virus play?

The adeno-Cre virus is used to excise the stem cell cassette from the host genome, ensuring factor-free hiPSCs.

Can this methodology be applied to other cell types?

Yes, the methodology can be adapted for reprogramming various adult human cell types.

Мы описываем протокол получения перепрограммированных и охарактеризованных безфакторных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на основе лентивирала и преобразования в предполагаемые клинические состояния.

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы получить лентивирусные репрограммированные бесфакторные индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки и преобразовать эти клетки в предполагаемые клинические условия. Это достигается путем предварительного перепрограммирования взрослых дермальных фибробластов человека с помощью одной увеличенной кассеты или стволовой тележки для стволовых клеток Ex-size в HI-PSCs. Затем перепрограммированные ПСК HI подвергаются воздействию вируса адено Cree purr для полного иссечения и удаления стволового автомобиля из генома хозяина.

Затем экстракция геномной ДНК из питающих свободных HI ПСК с последующим анализом агеля подтверждает правильность эксцизии стволового автомобиля. Наконец, ИПК с фактором три H преобразуются в предполагаемые условия содержания GMP с помощью медленной методологии преобразования в полностью определенные условия, свободные от ино. В конечном счете, вирусное перепрограммирование взрослых дермальных фибробластов человека и полная конверсия H IPC в клинические условия подчеркивает широкую применимость этой методологии для перепрограммирования взрослых клеток человека и преобразования их в клинически значимые условия.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos

Explore More Videos

Биологии стволовых клеток выпуск 93 человеческая индуцированных плюрипотентных стволовых клеток STEMCCA фактор-Free GMP Зенона бесплатно количественный ПЦР