Гибридная ДНК Добыча Метод для качественной и количественной оценки бактериальных сообществ из мяса птицы Образцы продукции

Общей целью данного эксперимента является разработка нового метода экстракции ДНК, сочетающего механическую гомогенизацию ДНК с удалением ингибитора ПЦР и метод золотого стандарта и соматической экстракции в образцы окружающей среды по всему континууму птицеводства. Это достигается путем разделения образца окружающей среды на микроцентрифужные пробирки, содержащие смесь гранул, для эффективной гомогенизации сложных образцов окружающей среды. Вторым шагом является помещение пробирок в мощный гомогенизатор для эффективного высвобождения нуклеиновых кислот из бактериальных клеток и матрицы окружающей среды.

Затем гомогенат используется в качестве исходного материала для золотого стандарта ферментативного метода экстракции ДНК через фазу связывания с ингибированием ПЦР. Последний шаг заключается в размещении образцов на роботизированной рабочей станции для экстракции ДНК, чтобы предоставить пользователю извлеченные образцы ДНК, пригодные для множества последующих применений, в конечном итоге количественная ПЦР и анализ микробиома с использованием алюминиевой платформы MiSeq, были использованы, чтобы показать, что этот новый гибридный метод обеспечивает наилучшую комбинацию качественных и количественных оценок общего бактериального сообщества по сравнению с обработкой образцов методом механической или ферментативной экстракции один. Этот метод позволяет получить представление об анализе микробных сообществ в континууме птицеводства, но он также может быть применен к другим сельскохозяйственным системам, таким как свиной скот или растениеводство, которое содержит аналогичные сложные образцы окружающей среды.

Сегодня эту процедуру будет демонстрировать Кейтлин Гриффин, студентка моей лаборатории. Для начала эксперимента установите водяную баню на 95 градусов Цельсия. Затем взвесьте три реплики по 0,33 грамма, чтобы проанализировать в общей сложности один грамм комнатной температуры, почвы или фекального материала в двухмиллилитровую лизеровую матрицу ET-трубки для смены перчаток между образцами.

Добавьте 825 микролитров буфера фосфата натрия и 275 микролитров раствора предварительного лизиса или PLS в пробирку с образцом. Затем обработайте образцы вихрем в течение 15 секунд, после смешивания центрифугируйте пробирки при давлении 14 000 G в течение пяти минут. Сцедите надосадочную жидкость и добавьте 700 микролитров буфера A SL. Затем закрутите трубку на пять секунд.

Открывайте по одной трубке за раз, чтобы предотвратить загрязнение. Затем убедитесь, что в конической пробирке имеется свободное пространство в размере 10% от общего объема, прежде чем помещать образцы в прибор для быстрой подготовки 24. Гомогенизируйте образцы со скоростью шесть метров в секунду в течение 40 секунд.

Обратите внимание на разницу между быстрой подготовкой 24 и вортексированием после гомогенизации. Центрифугируйте образец при давлении 14 000 G в течение пяти минут. Перенесите надосадочную жидкость в стерильную двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку, к оставшемуся образцу в лизирующей матричной ЭТ-пробирке дополнительно 700 микролитров SL-буфера для повторной гомогенизации и центрифуги.

Используя предыдущие настройки, поместите пластиковые стопорные зажимы на пробирки с образцами, чтобы они не открылись, и инкубируйте надосадочную жидкость на водяной бане при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем откройте каждую пробирку микроцентрифуги, чтобы сбросить давление, закройте пробирки и закрутите их на 15 секунд. Центрифугируйте образцы при давлении 14 000 GS в течение одной минуты.

После центрифугирования перелейте 1,2 миллилитра надосадочной жидкости в стерильную двухмиллилитровую микроцентрифугу. Затем поместите блистерную упаковку с язычком непосредственно на открытую микроцентрифужную пробирку и осторожно протолкните язычок из блистерной упаковки в пробирку. Чтобы избежать контакта между язычком ингибитора X и пробиркой, добавьте по одному язычку ингибитора X в каждый образец.

Затем сделайте пробирки вихревыми до тех пор, пока образцы не превратятся в равномерно грязно-белую жидкость. Инкубируйте образцы в течение одной минуты при комнатной температуре и центрифугируйте их при 14 000 тонн сыра в течение пяти минут, избегая при этом остатков частиц на дне пробирок. Переложите всю жидкость в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем центрифугируйте пробирки на полной скорости в течение пяти минут. Прежде чем начать автоматическую очистку ДНК, убедитесь, что на рабочей станции установлено соответствующее количество фильтрующих наконечников и буферов. Далее добавьте эллюцианские трубки и трубки фильтра к адаптерам ротора и добавьте по 400 микролитров каждого образца в среднюю прорезь адаптера ротора.

Поместите адаптеры ротора в центрифугу рабочей станции и убедитесь, что все крышки пробирок микроцентрифуг надежно закреплены внутри адаптера ротора. Добавьте раствор протеиназы К в стерильную микроцентрифугу объемом 1,5 мл и поместите ее в слот А на рабочей станции. Добавьте две миллилитровые пробирки микроцентрифуги с безопасным замком в секцию шейкера рабочей станции и убедитесь, что крышки пробирок с образцами надежно закреплены.

С помощью сенсорного экрана на рабочей станции выберите протокол обнаружения патогенов из ДНК кала человека и прочитайте последующие экраны, чтобы убедиться, что рабочая станция загружена правильно. После того, как все контрольные экраны пройдены, нажмите кнопку «Запустить» для запуска протокола. Затем извлеките образцы из адаптеров ротора.

Объедините три повторяющиеся очистки для отдельного образца с помощью центрифугированной системы на основе выпаривания. Повторно разбавьте образец до конечного объема 100 микролитров с помощью буфера tris EDTA. Наконец, закройте образцы крышками и поместите их при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся для последующего анализа.

Этот график демонстрирует, что механический метод неизменно обеспечивал общую самую высокую оценку общей нормализованной численности бактерий для образцов фекалий и подстилки. Ферментативный метод имел самые низкие оценки во всех случаях. Новый метод гибридной экстракции позволил получить наилучшую комбинацию качественных и количественных оценок общего бактериального сообщества.

Из трех проверенных методов экстракции. Теперь вы должны лучше понять, как использовать этот новый, полуавтоматический метод экстракции гибридной ДНК, и увидеть его полезность в качественной и количественной оценке микробных сообществ из сложных образцов окружающей среды.