Атомно-силовая микроскопия красных фонарей фоторецепторов Использование Mapping PeakForce Количественный Наномеханические недвижимости

Общая цель этой процедуры заключается в сборе изображений фоторецепторных белков с высоким разрешением с помощью атомно-силовой микроскопии. Это достигается путем предварительного получения образца фоторецептора и его разбавления. Второй шаг заключается в нанесении образца белка на только что расщепленную и чистую поверхность слюды примерно на 30 секунд.

Затем слюду промывают буфером для удаления несвязанных и слабо прикрепленных молекул. Далее образец прикрепляется к жидкостной ячейке, которая оснащена соответствующим зондом. Эта сборка загружается в сканер.

После заполнения жидкой ячейки буферным раствором зацепите наконечник с образцом и начните сканирование. В конечном счете, атомно-силовая микроскопия с учетом пиковой силы. Количественное наномеханическое картирование свойств используется для сбора изображений одиночного фоторецепторного белка на поверхности образца.

Атомно-силовая микроскопия, включающая в себя пиковые силы q и m, может ответить на ключевые вопросы в области молекулярной биологии, например, каковы важные структурные и химические характеристики, определяющие функцию биологически активных макромолекул. Основное преимущество этого метода перед современными методами, такими как ЯМР и рентгеновская кристаллография, заключается в том, что изображения интактных белков и других биологических макромолекул с высоким разрешением могут быть получены в биологически значимой среде. Как правило, люди, которые плохо знакомы с этим методом, испытывают трудности, потому что настройка зонда и решения требует нескольких шагов, некоторые из которых довольно сложны.

Благодаря пиковым силам q и m и автоматизированному программному обеспечению некоторые из этих шагов упрощаются, что значительно упрощает процесс для новых пользователей и студентов бакалавриата. Эту процедуру будут демонстрировать три студента бакалавриата из моей исследовательской лаборатории: Мари Крогер, Блэр Соренсон и Джессика Томас. В предстоящем году эти студенты будут обучаться в аспирантуре в области микробиологии, химической инженерии и химии.

Эти элементы должны быть включены в определенном порядке. Во-первых, компьютер, затем контроллер и, наконец, оптоволоконный свет. Микроскоп должен считывать FM и НЧ FM.

Камера должна быть центрирована над FM-оптической головкой в программном обеспечении. Следует выбрать следующее. Категория эксперимента – механические свойства.

Экспериментальная группа представляет собой количественное наномеханическое картирование, а эксперимент — пиковые силы q и m в жидкости. При правильном выборе настроек эксперимент можно загрузить и настроить. Фокусировка камеры должна быть сначала установлена с помощью объектива Z, а затем с помощью элементов управления курсом для позиционирования сцены, цель состоит в том, чтобы разместить отверстие головки A FM на один миллиметр перед поверхностью сцены, чтобы манипулировать дисками с образцами с помощью только что отколотой слюды с помощью круглого дискового захватного пинцета.

Начните со сборки жидкостной ячейки из безупречно очищенных деталей. Сначала прикрепите адаптер шланга к порту на ячейках чистой жидкости. Затем с помощью пинцета с плоской головкой очень осторожно вдавите уплотнительное кольцо в его углубление на ячейке жидкости.

Далее на зажиме фиксатора щупа слегка нажмите на пружину и поверните ее в сторону от паза. С помощью того же пинцета возьмитесь за щуп и просуньте его в углубление так, чтобы кончик был обращен к центру ячейки. Затем закрепите щуп с помощью зажима.

Следующим этапом является проверка хомута на А-FM.It должен быть полностью втянут. Поместите сборку вниз поверх образца. Установите узел на шпильки A FM для стабилизации.

Опустите зажим. Чтобы осмотреть уплотнительное кольцо, нажмите переключатель вниз на микроскопе до тех пор, пока не станет видно уплотнительное кольцо. Он должен быть плотно сжат между опорным диском и жидкостной ячейкой.

Жидкостную ячейку можно сфокусировать с помощью ручки грубой регулировки. Далее, используя регулировку XY, сфокусируйтесь на наконечнике щупа. Выглядит он как металлический золотой треугольник.

Теперь с помощью нижнего рычажка пизо переместите наконечник близко к поверхности образца, отрегулируйте фокус на наконечниках, отражениях, и следите за положением консолей по отношению к этому отражению. В настоящее время они должны быть близко выровнены, но не полностью перекрываться. Теперь подготовьте шприц.

Заполните его одним миллилитром буферного раствора и прикрепите адаптер. Затем присоедините шприц к шлангу для выброса и полностью выдвиньте поршень. Далее подсоедините шланг к ячейке жидкости с помощью адаптера для заполнения камеры, аккуратно нажмите на поршень до тех пор, пока центр камеры не заполнится.

Не должно быть никаких пузырьков воздуха или переливаний из жидкостной ячейки на микроскоп. Затем поместите шприц в хорошо поддерживаемое положение над камерой. Далее используйте ручки трансляции камеры и XY.

Чтобы найти лазер на экране, он должен отображаться в виде диффузной красной точки. После обнаружения используйте элементы управления лазером, чтобы переместить его к зонду. Теперь, наконец, отрегулируйте управление лазером и зеркалом до тех пор, пока суммарный сигнал на микроскопе не достигнет максимума в диапазоне от четырех до шести, отрегулируйте квадрантный диод.

Затем с помощью ручек сканирующей головки отрегулируйте вертикальные и горизонтальные отклонения до тех пор, пока значения на микроскопе не вернутся как можно ближе к нулю. Прежде чем продолжить, обязательно выберите подходящие варианты приобретения. Установите частоту сканирования примерно в один герц в окне выборок на линию.

Введите 256. Для сканирования вспомогательное автоматическое управление. Выберите индивидуально для помощи в сканировании, автоматическое ограничение по оси Z выберите выкл.

Предел Z должен составлять 500 нанометров, а размер скана — один микрон. Правильно установив настройки, измерьте щуп. Наблюдайте за изменением напряжения Z pazo по мере приближения наконечника щупа к поверхности.

Если наконечник выходит за пределы диапазона, изымается и снова приближается, возможно, потребуется заменить наконечник щупа. Если это не сработает, то при задействовании наконечника в каждом окне сбора данных должны появиться линии, и эти линии создадут изображение. Начните непрерывную съемку изображений слюды.

Медленно увеличивайте масштаб, чтобы убедиться, что поверхность MICA плоская и чистая. Приготовьте четырехкамерную чашку Петри с охлажденным буферным раствором для визуализации. На каждую камеру нужно не менее пяти миллилитров.

Перед тем как взять аликвоту разбавленного белка, аккуратно размешайте ее с помощью микропипетки. Затем возьмите 200 микролитров аликвоты и нанесите разведенный белок на поверхность MICA. Подождите около 30 секунд, пока раствор не остановится на поверхности.

Затем с помощью дисковых захватов поднимите диск, не наклоняя его, и сразу же погрузите его в первую лужу буферного раствора. В течение одной секунды убедитесь, что диск остается параллельным скамье. Очень важно, чтобы образец был расположен параллельно чашке Петри на этапе ополаскивания.

Эти мягкие, гибкие молекулы могут быть искажены на поверхности сильными потоками водного раствора. Далее ненадолго погрузите диск в каждый из трех других бассейнов на одну секунду в каждый бассейн. Затем переложите диск на сухую и непыльную ткань.

Дайте лишней влаге перейти на ткань, но не допускайте полного высыхания диска. Не допускайте соприкосновения ткани с образцом Осторожно извлеките образец из ткани с помощью дисковых захватов и поместите образец на сканер A FM. Поместите жидкостную ячейку поверх образца и приступайте к настройке и визуализации.

После всех параметров для щупа, размер пружины и радиус наконечника правильно выставлены. Оценивайте щуп так же, как и при визуализации. Мика, наблюдай за ZP azo, когда кончик приближается к поверхности.

При съемке позволяйте сканеру отображать одну и ту же область в течение как минимум двух последовательных проходов. Используйте непрерывную съемку для сохранения каждого изображения. Отрегулируйте размер и расположение изображения по своему усмотрению.

После того как автоматизированное программное обеспечение закончит настройку параметров сканирования для определенного размера изображения. Выключите программное обеспечение до предела. Настройте фокус изображения вручную, отрегулируйте скорость сканирования, предел Z, количество линий и заданное значение.

Если изображение становится слишком расфокусированным, снова включите программное обеспечение, чтобы вернуться в исходное исходное положение. Увеличивая масштаб белка, уменьшите скорость сканирования и увеличьте количество линий пропорционально, чтобы увеличить разрешение изображения. Позже. При анализе изображений, во-первых, сведите изображение, нажав на значок сглаживания.

Выберите нулевой ордер и выполните операцию. Иногда для получения достаточно плоских изображений необходимо использовать плоскую посадку. Выберите значок простой посадки и с помощью курсора нарисуйте плоскость над плоской областью на изображении.

Выполните плоскую посадку и при необходимости повторите операцию. Затем выберите вкладку поперечного сечения, чтобы измерить размеры белка. Наведите курсором линию на молекулу или область, которую нужно анализировать.

Повторите этот процесс в нескольких областях. Если требуется наложение, любое количество биологических молекул может быть изучено с помощью FM для фоторецепторного белка в его адаптированном к свету состоянии, свежерасщепленный субстрат из слюды является подходящей плоской поверхностью для абсорбции белка. Димеры белка одиночного фоторецептора можно было наблюдать в режиме QNM с пиковой силой.

Стрелки указывают на отдельные димеры, а звездочка обозначает агрегат белка с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Поперечные сечения белков могут быть измерены после сплющивания изображения. Данные XY коррелируют с измерениями высоты.

Их можно использовать для различных расчетов. После просмотра этого видео вы сможете организовать эксперимент A FM для сбора изображений белков с высоким разрешением на поверхности в биологически значимой среде. Используя пиковые силы q и m После освоения эта техника может быть выполнена примерно за три-четыре часа.

Таким образом, пиковые силы q и m являются подходящей формой атомно-силовой микроскопии для ознакомления студентов бакалавриата, обучающихся на лабораторных курсах, таких как инструментальный анализ, биохимия и современная физика. После своего развития этот метод открывает путь исследователям в области сканирующей зондовой микроскопии к исследованию биологических молекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты и даже живые клетки в биологически значимых средах.