Моделирование слизистой оболочки кандидоз мальков данио рерио по плавательного пузыря инъекций

Общая цель этой процедуры заключается в моделировании кандидоза слизистой оболочки с использованием молоди рыбок данио. Это достигается путем предварительной загрузки раствора, содержащего живые альбиканы, в микроиглу. На втором этапе определенный объем дрожжевых клеток вводится в плавательный пузырь молоди рыб данио-рерио.

Далее рыб проверяют на наличие однородного инокулята и инкубируют в течение желаемого времени. На заключительном этапе используется конфокальная микроскопия, чтобы проследить динамическое взаимодействие патогена с иммунной системой рыбок данио. Кроме того, плавательный пузырь может быть рассечен микроами для получения конфокальных изображений с более высоким разрешением.

Метод, который мы представляем здесь, отвечает на ключевые вопросы грибковой иммунологии, а также микробиологии, например, какова точная последовательность событий, приводящих к неудачному иммунному ответу на грибковый патоген и кандидозные маяки на поверхности слизистых оболочек. Перед началом процедуры подогрейте в инкубаторе с температурой 33 градуса Цельсия чашку для инъекций, содержащую 2%. Через 30 минут с помощью пипетки объемом 25 миллилитров удалите 100 миллилитров питательных веществ Е три плюс ПТУ с тарелки четвертого дня, после оплодотворения рыбок данио, стараясь не допустить аспирации ни одной из рыб, и добавьте два миллилитра по четыре миллиграмма на миллилитр.

Трика сульфоната метана поступает в среду для обезболивания животных. Через 15 минут с помощью препарирующего микроскопа определите рыб с надутыми плавательными пузырями и с помощью пластиковой пересадочной пипетки переложите 30 рыбок данио в предварительно подогретую миску для инъекций. Удалите излишки среды, затем держите тарелку под углом и с помощью лески диаметром 0,012 дюйма, супер приклеенной к боросиликатному капилляру, сделайте три лески по 10 вертикально выровненных рыб, каждую из которых тщательно обваляйте трубку свежеприготовленных морских альбиканов в концентрации от 1,5 до 10 до семи КОЕ на миллилитр.

А затем загрузить три микролитра дрожжевого раствора в ЕС обрезанную микроиглу. Установите длительность импульса на соответствующую настройку. Затем поверните чашку для инъекций, чтобы достичь угла в 20 градусов между микроиглой и головой рыбы, направленной в сторону задней части плавательного пузыря.

Теперь протолкните микроиглу в плавательный пузырь, убедившись, что отверстие иглы находится в просвете и прижмите лужу. После того, как проверка того, какая рыба была введена, относительно проста, так как болюс вытесняет воздушный пузырь, а задняя часть плавательного пузыря впоследствии заполняется средой, совместное впрыскивание фенолового красного с болюсом может еще больше облегчить визуализацию успешной инъекции. После введения всех 30 рыб залейте чашку Е три среды, а затем высыпьте рыбу в чашку для восстановления.

Пересадите 10 животных в центрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитра, содержащую один миллилитр Е-трех сред, и усыпьте рыб 200 микролитрами трики. Затем для каждого животного разложите по четыре капли вакуумной смазки в квадрате, расположенном на расстоянии одного сантиметра друг от друга, на микрогорке, и добавьте две капли свежеприготовленного, не плавящегося на 2% месте, в середину квадрата. Далее поместите одну рыбку на отдельное предметное стекло под вскрывающий микроскоп и убедитесь, что сердце животного перестало биться и удалите лишнюю воду.

Теперь используйте одну пару тонких пинцетов, чтобы удерживать голову в фиксированном положении, а другую — чтобы потянуть вниз переднюю кишку. Возьмите плавательный пузырь за пневматический проток, отделяющий его от пищеварительного тракта, и поместите его в центр одной из подготовленных микрогорок до того, как агро затвердеет. Наконец, наденьте на салфетку защитный листок, осторожно надавливая вниз, пока он не коснется вакуумной смазки и агарозы, и сфотографируйте плавательный пузырь в течение 10 минут после сбора.

Введение четырех нанолитров морских альбиканов в соотношении от одного до 1,5 умножить на 10 седьмых. КОЕ на миллилитр дает наиболее согласованные данные, что приводит к диапазону от 10 до 50 дрожжевых клеток на рыбу. Сужение посевного материала до 15-25 дрожжевых клеток дает еще более плотный фенотип и реакцию.

Нейтрофилы играют ключевую роль в устойчивости к кандидозу у мышей и человека, а заражение плавательного пузыря рыбок данио живыми альбиканами приводит к быстрому и устойчивому набору нейтрофилов. Этого не происходит, когда вводятся дрожжевые клетки, убивающие тепло. Филаменты быстро развиваются после инъекции дрожжевых клеток, при этом нитевидный рост продолжается в течение первых 24 часов после инъекции, после чего это число начинает снижаться.

Экспериментальный протокол, который остается непрактичным в визуализации мышей, взаимодействие иммунных или эпителиальных клеток с c. albicans относительно прост в представленной здесь модели. Тем не менее, вскрытие плавательного пузыря, как только что продемонстрировано, значительно улучшает качество визуализации. Это особенно полезно при визуализации трансгенных рыбных линий, где флуоресценция выражена повсеместно, а в окружающих тканях присутствует посторонняя флуоресценция, как это видно на этих изображениях рассеченного плавательного пузыря из рыбной лески альфа-катина.

Следуя этой процедуре. Другие методы, такие как морфотерапия или химическое ингибирование, могут быть использованы для ответа на вопрос, например, какова роль конкретной иммунной клетки или сигнального пути в кандидозе слизистой оболочки.