Одновременное количественное определение Т-клеточного рецептора иссечение Круги (TRECs) и K-Удаление рекомбинация Вырезание кругов (KRECs) по ПЦР в реальном времени

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы оценить выход тимуса и костного мозга путем количественного определения кругов эксцизионного рецептора Т-клеток или REX и K, удаляя круги рекомбинационной эксцизии или коррекции в одном анализе. Это достигается путем создания плазмиды с тройной вставкой, содержащей фрагменты последовательности ДНК коррективов TRX и референсного гена с одной копией, чтобы поддерживать соотношение один к одному между тремя мишенями после амплификации ДНК. Затем строится стандартная кривая путем последовательного разведения плазмиды с тройной вставкой, что позволяет абсолютно количественно оценить три целевые последовательности с помощью ПЦР в реальном времени.

Наконец, проводится ПЦР-анализ в реальном времени, что приводит к абсолютному количественному определению tres и трещин. Представленные результаты показывают изменения выхода тимуса и костного мозга в зависимости от возраста и пола у здоровых детей и взрослых. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда нам нужно было проанализировать костный мозг и выход тимуса у новорожденных или младенцев, учитывая, что количество обычно берущейся крови невелико по сравнению со взрослыми.

Поэтому мы решили объединить два метода количественного определения треков и коррекций в один анализ, чтобы оптимизировать пробоподготовку и затраты на реагенты. Применение этого метода распространяется на диагностику первичных и приобретенных иммунодефицитов, но метод также может быть использован при всех заболеваниях, связанных с потерей клеток TMB, а также для изучения нового восстановления после трансплантации костного мозга. Он также может быть применен к фундаментальным исследованиям, в основном связанным с гомеостазом лимфоцитов.

Основным преимуществом является то, что при использовании тройного профицита требуется только одно стандартное лечение, что снижает экспериментальную вариабельность. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности из-за длительной процедуры, необходимой для подготовки плазмиды с тройной вставкой, или из-за проблем, связанных со стандартным препарированием кривой. Для начала получить образец, содержащий клетки, которые с большой вероятностью могут иметь TRX и трещины, обнаруживаемые с помощью ПЦР, такие как периферическая кровь молодого здорового субъекта, собранная в пробирки ЭДТА с использованием стандартного метода разделения градиента плотности.

Отделяют мононуклеарные клетки периферической крови после извлечения ДНК из клеток в соответствии с текстовым протоколом, используют праймеры, специфичные для Fort TRX REX и TCR alpha constant gene для усиления сигнала Rex, совместного сигнального сустава Rex и фрагментов гена TCR alpha constant. Вставьте продукт ПЦР сигнального соединения Trax в акцепторный сайт TA топовектора PCR 2.1 и используйте плазмидную ДНК для трансформации химически компетентных клеток XL one blue с помощью теплового шока, изолируйте устойчивые к ампициллину белые колонии, которые потеряли комплементацию бета-лактазы, на новую мастер-чашку и используйте ПЦР для идентификации колоний, содержащих фрагмент Trek. После выращивания одной из трек-положительных колоний и выделения ДНК используйте SP 1 для расщепления плазмиды и амплифицированного продукта гена TCR alpha constant и литирования фрагмента гена TCR alpha constant в плазмиду.

Повторите трансформацию, отбор и расширение колоний и выделение ДНК для вставки правильного фрагмента, используйте три задних вместо SP для переваривания плазмиды и правильного фрагмента ПЦР и повторите процесс для лигирования и изоляции ДНК. После того, как последовательности трех вставок будут проверены, расширьте колонию и очистите плазмидную ДНК с помощью MIDI-препа в соответствии с текстовым протоколом для подготовки стандартной кривой. После вычисления массы и концентрации плазмиды, как показано здесь, разморозьте аликвоту плазмиды, и вы покажете одну из них, чтобы линеаризировать два микрограмма с линеаризованной аликвотой ДНК.

Используйте формулу С один В один равно С два В два. Чтобы рассчитать объем разрежения, необходимый для подготовки первой точки стандартной кривой ряда, как показано здесь, подготовьте серию от одного до 10 разрежений для получения оставшихся точек стандартной кривой. Храните разведенную плазмиду при отрицательной температуре 80 градусов Цельсия до использования Для подготовки образцов для ПЦР в реальном времени организуйте ПЦР-планшет, который включает не менее двух реплик для каждого анализируемого образца следующим образом, с двумя отдельными пробирками, одна для Rex и трещин, а другая для альфа-константы TCR.

Подготовьте мастер-смеси на общее количество необходимых скважин. Добавьте 20 микролитров в лунки тарелки. Затем добавьте пять микролитров геномной ДНК, извлеченной из мононуклеарных клеток периферической крови или P BMC.

Добавьте пять микролитров воды в контрольные лунки без шаблона, прежде чем использовать оптическую адгезивную крышку для герметизации реакционной пластины. Затем разморозьте плазмидную ДНК стандартным разведением кривой и приготовьте максимальное разведение. Откройте только лунки, расположенные между рядами от A до H и столбцами с первого по четвертый.

И после непродолжительного вортекса добавить по пять микролитров каждой точки разведения к назначенной. Хорошо следите за тем, чтобы на дне лунок не было пузырьков и чтобы реагенты осели на дне. Используйте систему ПЦР в реальном времени для проведения анализа по следующему протоколу.

50 градусов Цельсия в течение двух минут и первоначальный нагрев до 95 градусов Цельсия в течение 10 минут, за которыми следуют 45 циклов денатурации при 95 градусах Цельсия в течение 15 секунд. А комбинированный праймерный щуп с коленом и удлинением при 60 градусах Цельсия в течение одной минуты. Чтобы проанализировать данные ПЦР в режиме реального времени, откройте сохраненный файл результатов в программном обеспечении и нажмите на вкладку результатов в верхней части окна.

Нажмите на меню анализа и выберите настройки анализа. Позвольте программному обеспечению автоматически определять порог, выбирая все детекторы, и автоматическую КТ для порогового цикла. Позвольте программному обеспечению установить автоматический базовый уровень для удаления фона по умолчанию.

Нажмите на вкладку с именем График усиления, и в правой части окна выберите один из трех детекторов в соответствующем выпадающем меню. Чуть ниже выберите ручную КТ для ручной установки порога в нижней части окна, выберите лунки, соответствующие стандартным точкам разведения кривой выбранного детектора, чтобы показать графики усиления, щелкнув и проведя мышью по соответствующим ячейкам таблицы. Чтобы настроить пороговое значение вручную, перетащите красную линию порога вверх и вниз, а затем нажмите кнопку «Анализ» для повторного анализа результатов.

Чтобы проверить, как установка порога влияет на результаты, выберите вкладку отчета и посмотрите результирующую КТ соответствующих точек разведения стандартной кривой. При перемещении порога для получения оптимального размещения на вкладке графика усиления убедитесь, что порог находится в области экспоненциального усиления, достаточно выше фонового шума, но ниже фазы плато. Если график усиления не отображается в логарифмическом масштабе, щелкните правой кнопкой мыши на графике, чтобы вызвать настройки графика, и установите настройку Y ais после прогона как log.

Установите порог на полпути в линейной части графика и наблюдайте за кривыми усиления, примерно параллельными друг другу. Нажмите на вкладку отчета, чтобы увидеть результаты КТ. Убедитесь, что размещение пороговых значений дает результаты, максимально повышающие точность двух повторений каждой стандартной кривой.

Точки разбавления. Убедитесь, что пороговое значение установлено в точке, которая наилучшим образом отражает крайние порядки величин точек разрежения стандартной кривой на вкладке отчета. Снова перетащите мышь в таблицу в нижней части окна, чтобы выбрать ячейки, соответствующие лункам стандартной кривой Для всех детекторов убедитесь, что результирующая КТ трех мишеней очень схожа в одних и тех же точках разведения.

Например, разница, не более 0,5 CT, при необходимости отрегулируйте пороговые значения и перепроверьте под вкладкой отчета в нижней части окна. Выберите лунки NTC и убедитесь, что в лунках NTC отсутствует амплификация, что соответствует неопределенному CT. Выберите вкладку «Стандартная кривая» и справа от окна графика выберите детекторы в раскрывающемся меню и посмотрите, находится ли заявленный стандартный наклон кривой в диапазоне от отрицательных 3,55 до отрицательных 3,32, что соответствует эффективности ПЦР от 91 до 100%.

Нажмите на вкладку отчета и в соответствующих ячейках таблицы под графиком убедитесь, что КТ положительного контроля согласуется с результатами предыдущих анализов на том же известном положительном контроле. Нажмите на меню «Файл», сохраните, а затем экспортируйте в файл CSV, чтобы экспортировать количество всех скважин в текстовом файле, содержащем значения, разделенные запятыми. Наконец, импортируйте файл CSV в программное обеспечение для работы с электронными таблицами и рассчитайте количество треков или исправлений на каждые 10 или шесть PBM, установив следующую формулу соответствующим образом.

Анализ, описанный в этом видео, был проведен на репрезентативной выборке из 87 здоровых людей контрольной группы. 42 ребенка в возрасте от нуля до 17 лет и 45 взрослых в возрасте от 24 до 60 лет. Как показано здесь, количество походов резко уменьшалось с возрастом из-за инволюции тимуса с нуля до трех-четырех лет у взрослых.

Число треков также зависит от пола, потому что у мужчин оно уменьшается быстрее, чем у женщин, что может повлиять на способность устанавливать соответствующие референсные диапазоны. Эти графики показывают, что количество трещин, однако, уменьшается с возрастом, подобно тому, как это наблюдается с Т-TREX только у детей. Тогда как у взрослых людей выход костного мозга достаточно стабилен на протяжении всей жизни и не зависит от пола.

Тройной ввод плазмидного препарата занимает около двух-трех недель, но после этого накопленного количества плазмид хватит на три года. Оставшаяся часть техники может быть выполнена всего за четыре-пять часов при правильном выполнении. При попытке выполнить эту процедуру очень важно выполнять все манипуляции, связанные с плазмидами, в специально отведенной области, чтобы избежать перекрестного загрязнения ДНК.

Также важно проверить стабильность стандартной трубки при анализе результатов после ее разработки. Этот метод предоставил исследователям в области клинической иммунологии или гематологии усовершенствованный инструмент для выявления первичных иммунодефицитов для мониторинга результатов восстановления иммунитета после трансплантации костного мозга или просто для изучения гомеостаза лимфоцитов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить тройку в плазмиде, подготовить стандартную кривую, провести эксперимент ПЦР в реальном времени и выполнить необходимые расчеты, необходимые для получения воспроизводимой абсолютной количественной оценки траксов и трещин.