Изготовление Комплексные Субстраты культуры с помощью робота-микроконтактной печати (R-μCP) и Sequential нуклеофильного замещения

Общая цель данного эксперимента заключается в создании субстратов для тканевых культур с помощью нескольких микрошаблонов ПЭГ-кистей, представляющих ортогональные химические составы, которые обеспечивают пространственно точную и сайт-специфичную иммобилизацию биологических лигандов. Это достигается за счет осаждения массивов акантиола, инициатора TRP, с помощью роботизированной микроконтактной печати на подложках с золотым покрытием. В качестве второго этапа SI на подложках с микрорисунком выполняется TRP, в результате которого образуются щетки PEG с концевыми бромными группами.

Затем концевые бромные группы функционализируют одной или двумя химически реакционноспособными группами, чтобы обеспечить имманентную мобилизацию надлежащим образом подготовленных биологических лигандов. Затем весь процесс повторяется для функционализации со второй химической группой. Результаты показывают микрочипы из двух ортогонально функционализированных PEG-щеток, наложенных друг на друга с точностью до 10 микрон.

Это проверяется с помощью специального программного обеспечения для анализа изображений после сопряжения реакционноспособных групп с флуоресцентными молекулами. Основное преимущество этой технологии перед такими методами, как ручная микроконтактная печать, заключается в том, что роботизированная микроконтактная печать способна накладывать несколько этапов печати с точностью до микрона, а также обеспечивает максимальную гибкость и дизайн подложки. Точность, обеспечиваемая этим методом, в сочетании с последовательными реакциями нуклеофильного замещения, позволяет нам создавать субстраты для тканевых культур, которые функционализированы несколькими биологическими лигандами, которые затем способны осуществлять временной и пространственный контроль сульфата в микронном масштабе.

До появления S-I-A-T-R-P на позолоченной крышке должен был быть нанесен штамп A-P-D-M-S. Эта относительно распространенная процедура объясняется в текстовом протоколе. Начните с снятия затвора патентной крышки с робота, отпустив пылесос.

Затем переложите его в колбу объемом 50 миллилитров, запечатайте колбу и примените вакуум с отрицательным давлением 30 фунтов на квадратный дюйм. Затем добавьте 5,5 миллилитров реакционной смеси A TRP в колбу с помощью шприца с последующим добавлением 0,5 миллилитров аскорбата натрия в воду также через шприц. Наблюдайте за реакцией изменения цвета от светло-зеленого до темно-коричневого.

Дайте реакции продолжаться в течение 16 часов под инертным газом. Когда реакция завершится, снимите крышку и промойте ее этанолом, затем водой, а затем снова этанолом. Затем аккуратно просушите его азотом.

Микрочип привитых кистей P-E-G-M-E-M-A должен быть виден невооруженным глазом. Используйте микроскопию, чтобы подробно выявить эти изменения, чтобы Азад мог функционализировать, цепочки P-E-G-M-E-M-A. Переложите предметное стекло в стеклянный флакон объемом 20 миллилитров и добавьте шесть миллилитров ДМФА, содержащего 100 миллимолярный азид натрия.

Дайте реакции идти в течение 24 часов при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующий день промойте предметное стекло с помощью этанола и высушите его под слабой струей азота, чтобы успокоить оставшиеся бромные функциональные цепи P-E-G-M-E-M-A. Переложите предметное стекло с микроузором в стеклянный реакционный флакон объемом 20 миллилитров и добавьте шесть миллилитров ДМСО, содержащего 100 миллимоларного этанола, и 300 миллимоллярного триэтиламина.

Дайте этой реакции протекать в течение 24 часов при температуре 40 градусов Цельсия на следующий день. Промойте выкройку, накройте горку этанолом и аккуратно просушите ее под струей азота. Следующим шагом является повторение микроконтактной печати роботом с использованием второго штампа PDMS и последующего тиснения.

Используйте SI A TRP еще раз, чтобы построить график второй кисти микрочипа PEG. Затем наступает время функционализации ацетилена второго микрочипа P-E-G-M-E-A цепей Франсуа. Крышка с микроузором.

Поместите в стеклянный флакон объемом 20 миллилитров с шестью миллилитрами 100 миллилитров пропажного амина 100 миллилитров в ДМФА. Дайте реакции протекать в течение 24 часов. При комнатной температуре на следующий день промойте лакированную крышку предметным знаком с этанолом и высушите под слабой струей азота.

После этого предметное стекло с патентованной крышкой готово к витанию биотина. Начните с помещения предметного стекла в стеклянный флакон объемом 20 миллилитров. Во-первых, биотин поедал ацетиленовые оканчивающиеся цепи.

Добавьте шесть миллилитров сульфата меди с азидом PEG четыре конъюгата биотина в реакционный флакон, а затем 1,2 миллилитра 0,15. Миллимолярную рбиновую кислоту в воде для инициализации реакции проведите в барботаже реакцию с азотом в течение 10 секунд. Затем закупорьте флакон параформой и дайте реакции идти в течение 24 часов.

При комнатной температуре на следующий день промойте крышку горки водой и переложите ее в 12-ти луночную посуду из полистирола. Затем при комнатной температуре в DPBS с ослиной сывороткой в течение часа через час, окрашивание в группы биотина стрептококком DEIN 5 46 конъюгатом в дозе два микрограмма на миллилитр в DPBS окрашивание в течение двух часов при комнатной температуре через два часа. Промойте покровную горку в DPBS пять раз с нежной растительностью.

Tobi ITIN aate azi с концевыми цепочками. Поместите крышку стекла в лунку из шестилуночного полистирольного листа и нанесите два миллилитра DPBS, содержащего 20 микромолярных D-B-C-O-P-G четырех биотинов. Затем инкубируйте предметное стекло в течение 24 часов при комнатной температуре через 24 часа.

Прополощите чехол как перед четырьмя и испачкайте его стрептавидином 4 88. Конъюгат по два микрограмма на миллилитр в DPBS. Два часа спустя.

Еще раз промойте предметное стекло крышки, затем сфотографируйте его с помощью микроскопии. С помощью этого робота используется протокол микроконтактной печати. Точно структурированный массив пользовательского интерфейса ИНС кисти PEG с концевыми группами алкинов был объединен в отдельный массив более крупных пользовательских интерфейсов ИНС кисти PEG с конечными ази-группами.

Пространственное распределение азидных и алкин-групп рассматривали с помощью клик-химии и связывания стрептавидина флуоресцентных зондов. Наложение обоих флуоресцентных каналов показывает, как марки не перекрывались. Точность юстировки была рассчитана на уровне менее 10 микрон, что находится на пределе SCAR.

Система, используемая для печати. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создавать нестандартные подложки для тканевых культур с помощью роботизированной микроконтактной печати для наложения нескольких массивов стержневых кистей. Функционализирован ортогональной химией.