Процедура имплантации спинного палату для продольных В Vivo Визуализация мозга мыши спинного

В этом видео мы опишем процедуру имплантации хронический оптического изображения камеры на спинной спинного мозга живую мышь. Камера, хирургическая процедура, и хронический изображений пересматриваются и продемонстрировал.

Общая цель этой процедуры заключается в имплантации камеры визуализации над спинным мозгом мыши для обеспечения продольной оптической визуализации без необходимости повторных хирургических припадков. Это достигается путем обнажения трех грудных позвонков и удаления мягких тканей над позвоночником. Вторым этапом является зажим обнаженных позвонков с помощью боковых частей камеры и выполнение дорсальной ламинэктомии.

Далее верхняя пластина камеры прочно прикрепляется к обнаженному спинному мозгу и герметизируется с помощью силиконового эластомера и покровного стекла. Заключительным этапом является герметизация кожи вокруг имплантата с помощью клея и предоставление животному возможности восстановиться. В конечном счете, многофотонная флуоресцентная микроскопия используется для визуализации клеточного поведения и структуры тканей в спинном мозге с субклеточным разрешением с течением времени.

Основным преимуществом нашей новой методологии по сравнению с существующими методами, такими как повторное хирургическое вскрытие спинного мозга, является возможность получения практически произвольного количества точек визуализации, распределенных на длительный период времени без осложнений, связанных с повторной операцией, таких как потенциальная инфекция, хирургическая травма или стресс животных. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы рассматривали предыдущий успех продольной визуализации после травмы спинного мозга у прозрачной рыбы данио. Затем мы решили распространить эту парадигму на модель млекопитающих.

Начните эту процедуру с бритья области грудной дуги мыши, обезболенной с помощью изофтора. Затем удалите подстриженные волосы. Затем введите мышам подкожно смесь физиологического раствора, кетопрофена и дексаметазона.

С помощью ватных палочек. Выполните три чередующиеся промывки йода и 70% этанола и подождите одну минуту между стирками. После этого введите 100 микролитров 0,125% бупивакаина в центр выбритого участка подкожно, чтобы уменьшить боль в месте разреза.

Затем переведите мышь в режим пользовательских стереоатак. Вставьте ректальный термометр и подождите примерно 10 минут, пока бупивакаин начнет действовать под микроскопом. Сделайте пятимиллиметровый разрез над интересующими позвонками с помощью лезвия скальпеля.

После этого увеличьте размер отверстия в коже путем тупого рассечения. Далее аккуратно диссоциируйте соединительную фасцию между кожей и нижележащей мышцей. Удерживайте кожу назад, чтобы увеличить рабочую зону с помощью ретракторов, и будьте осторожны, чтобы не увеличить вес на грудную клетку и не затруднить дыхание.

Затем обхватите ростральный, большую часть позвонка, который будет обнажен через вышележащую мышцу с помощью пары щипцов. Разрежьте ткани с обеих сторон спинного отростка от трех позвонков. Впоследствии удалите все вышележащие ткани с дорсального ламината.

После этого осторожно отрежьте сухожилия, прикрепленные к позвонкам по обоим боковым краям позвоночного столба. Аккуратно удалите как можно больше ткани с боковых краев позвоночного столба, чтобы обеспечить чистую поверхность зажима. Затем аккуратно очистите позвонки от оставшихся мягких тканей.

С помощью скребка для кости и ватного тампона обрежьте все несочетаемые ткани с помощью хирургических ножниц. Затем отрегулируйте ретракторы, чтобы удерживать ткани, окружающие позвоночный столб. Вместе с кожей прикрепите боковые планки имплантата к зубцам на столбах для доставки и поместите их в держатели столбов.

Далее зажмите три позвонка. Использование боковых панелей с достаточным давлением, чтобы надежно их удерживать. Затем с помощью щипцов обеспечьте равномерное зажатие трех позвонков.

Перед выполнением ламинэктомии убедитесь, что боковые панели выровнены и параллельны. После этого тщательно очистите и высушите тыльную поверхность зажатых позвонков с помощью ватных палочек. При этой процедуре кончики ножниц Vana вставляются в эпидуральное пространство медиального зажатого позвонка и слегка сжимают ручки.

Если косточка сухая, она должна треснуть вдоль спинной пластинки. Повторите эту процедуру на контралатеральной стороне, чтобы освободить пластинку, одновременно захватывая свободную пластинку Аккуратно за спинной отросток с помощью щипцов осторожно отрежьте любую соединительную ткань на ростральном и зубчатом концах пластинки. Затем тщательно смойте всю кровь, лежащую над спинным мозгом, с помощью 0,9%-ного физиологического раствора или искусственно впитайте лишнюю жидкость с помощью ватных палочек.

После этого обрежьте боковые края кости и приступайте к боковым планкам имплантата. Впоследствии остановите кровотечение с помощью ватных палочек и физраствора. В том случае, если часть надкостницы оторвалась и залегает над спинным мозгом, аккуратно удалите ткань с помощью ватных тампонов и иглы 29-30 калибра.

Будьте осторожны, чтобы не травмировать спинной мозг и не перепутайте рыхлую надкостницу с плотно завернутым датором. В конце. Запечатайте оставшиеся открытые края кости зубным, акриловым и цианоакрилатом.

Будьте особенно осторожны, чтобы клей не попал на открытый спинной мозг. Теперь осторожно расположите верхнюю пластину на животном так, чтобы четыре прорези совпадали с четырьмя отверстиями на боковых планках, а отверстие находилось над открытым спинным мозгом. С помощью ювелирной отвертки аккуратно начните с первого винта, стабилизируя стержень отвертки еще одной парой щипцов.

Не затягивайте винт на этом этапе, а вставьте его так, чтобы первые несколько нитей были зацеплены. Повторите этот процесс для трех других винтов. Когда все четыре винта на месте, затягивайте каждый винт поочередно с таким же небольшим шагом, пока все винты не будут надежно закреплены.

Затем с помощью силиконового эластомера марки Quick Sill заполните пространство между спинным мозгом и стеклянным окном и нанесите его на открытый спинной мозг. Обязательно избавьтесь от любых силиконсодержащих пузырьков воздуха с наконечника для смешивания перед его нанесением. Затем быстро вставьте пятимиллиметровую крышку во вставку в верхней пластине.

Приложите достаточное давление, чтобы постепенно выдавливать жидкий эластомер, чтобы он окружал спинной мозг, но не приводя к сжатию спинного мозга. После этого покройте края выделяемого эластомера зубным, акриловым и цианоакрилатом и используйте клеи, чтобы максимально приклеить эластомер к окружающей кости, чтобы предотвратить смещение эластомера по поверхности спинного мозга. Затем снимите ретракторы и подтяните кожу вверх по краю имплантата.

Используйте цианоакрилат для приклеивания кожи к краям имплантата. После этого вставьте винты в крылья верхней пластины. Впоследствии загерметизируйте зазоры в пазах для винтов верхней пластины с помощью стоматологического акрила, прежде чем поместить животное обратно в клетку для восстановления.

Перед сеансами визуализации снова обезболите мышь и прикрепите открытые винты имплантата к резьбовым штифтам для стабилизации. Этот рисунок показывает, что хроническая камера позвоночника остается оптически прозрачной в течение нескольких недель. Это белые или светлые изображения спинного мозга в период от нескольких минут до трех недель после операции.

Сосудистые ориентиры можно идентифицировать во всех временных точках. В течение одного дня после операции заметны незначительные изменения. Плотный фиброзный разрастание присутствует в части окна уже через три дня и приводит к частичному запутыванию области визуализации.

Легкая неоваскуляризация также присутствует, но не затеняет исходную сосудистую сеть при белом свете или визуализации с двумя PEF. Хроническая камера позвоночника позволяет проводить повторную многофотонную визуализацию без необходимости повторных операций. Вот изображения трансгенной мыши, экспрессирующей YFP в подмножестве аксонов DRG в дорсальных отделах спинного мозга.

Сосудистая сеть была помечена внутрисосудистым введением красителя, показанным красным цветом. Активность микроглии также может быть отслежена с течением времени у одной YFP CX трех CR, одной GFP, двойной трансгенной мыши, в то время как аксоны и микроглия остаются видимыми. Контрастность и разрешение со временем незначительно снижаются.

После освоения. Эту технику можно выполнить примерно за один час, если она выполнена правильно после ее освоения. Этот метод проложил нам путь к исследованию временной и пространственной гетерогенности отмирания аксонов после травмы спинного мозга.

И мыши.