Нервно-мышечном соединении: Synapse размер измерение, фрагментации и изменения в синаптической белка плотности с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в объективной количественной оценке синаптических параметров, включая размер синапса, фрагментацию и относительную плотность белков в постсинаптической мембране. Это достигается путем предварительного препарирования интересующей мышцы у экспериментальных животных. Далее рассеченная мышца подвергается криорезу, а срезы подвергаются иммуноокрашиванию для флуоресцентной микроскопии.

Затем на фос объективно отбираются изображения нервно-мышечных соединений из различных групп лечения, а также количественно оценивается относительная интенсивность окрашивания для синаптических специализаций. В конечном счете, воспроизводимые количественные измерения влияния лечения или генетической модификации на структурную организацию нервно-мышечного соединения получают с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод обеспечивает стандартизированные объективные протоколы с использованием конфокальной микроскопии для оценки изменений в структуре нервно-мышечного соединения у мышей с такими расстройствами, как миастения и болезнь двигательных нейронов.

Как правило, люди, которые пытаются использовать этот метод, могут столкнуться с трудностями, потому что отбор проб NPLS на конфокальном микроскопе непредвзятым и объективным образом требует планирования. После выделения криосекции и иммунофлуоресцентного окрашивания, нервно-мышечные соединения мышей или NJS, в соответствии с текстовым протоколом, ослепляют слайды, помечая каждый из них случайным числом, которое остается известным только второму исследователю до тех пор, пока не будет завершена количественная оценка параметров NMJ. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и используйте набор фильтров trit C для просмотра его при широком освещении.

Постепенно перемещайтесь по полям слева направо и назад до тех пор, пока в поле не появится торцевая пластина с конфокальным отверстием, установленным на единицу измерения 1,0 airy, и, используя низкую мощность лазера, оптимизируйте уровни усиления и смещения для трита C red BGT на торцевой пластине, которую необходимо изобразить. Затем, используя 488-нанометровый лазер, оптимизируйте флуоресценцию C, которая представляет собой синаптофизин, затем соберите стек Z торцевой пластины с интервалом 0,7 микрона между каждым оптическим срезом. Сохраните изображения с именем файла, которое включает дату сеанса визуализации, кодовое имя предметного стекла и номер торцевой пластины.

Повторяйте только что продемонстрированную процедуру отбора проб и визуализации до тех пор, пока из предметного стекла или образца не будет собрано 20 торцевых пластин. А затем повторите процесс для остальных закодированных слайдов с теми же конфокальными настройками. Сделайте несколько изображений с управляющего слайда.

Используйте бесплатное программное обеспечение image J, чтобы открыть Zack и в одном флуоресцентном канале подготовить изображение максимальной проекции. Сохраните проекции в виде файлов TIF с именем файла, включая дату сеанса изображения, код образца, номер торцевой пластины и флуоресцентный канал. Теперь используйте изображение J, чтобы открыть проекцию Z.

Выберите ацетилхолиновый рецептор или канал изображения A CHR и выберите тип изображения восемь бит, чтобы преобразовать цветное изображение 24-битного RGB в одно восьмибитное изображение в оттенках серого на экране с помощью инструмента «Многоугольник». В красном канале для окрашивания BGT нарисуйте примерный контур вокруг интересующей торцевой пластины, исключив любые пятна, которые не исходят от интересующей торцевой пластины. Выберите порог настройки изображения, чтобы применить к изображению минимальный порог интенсивности.

Отрегулируйте пороговый уровень, чтобы изолировать участки, окрашенные A CHR, исключив окружающий фоновый сигнал в качестве подпорога. Затем откройте второе окно с исходным полнотоновым изображением для сравнения. Чтобы подтвердить пороговые настройки при наличии контура полигона, выберите во всплывающем меню пункт «Анализировать, анализировать частицы».

Укажите диапазон размеров в количестве пикселей от 50 до бесконечности, что исключает выделение мельчайших артефактов, возникающих из-за электрических шумов. В фотоумножителе нажмите «Анализировать частицы», чтобы создать окно со списком дискретных надпороговых областей и их значениями интенсивности флуоресценции, пронумерованными по мере их появления на двоичном изображении. Скопируйте эти данные в таблицу с метками, чтобы измерить общую площадь торцевой пластины.

В пределах полигона выберите Анализировать, измерить, скопируйте и вставьте данные для областей и интенсивностей CHR в электронную таблицу с помеченными столбцами. Переключитесь на канал синаптофизина. Подготовьте изображение максимальной проекции.

Выберите область интереса и установите минимальный порог интенсивности, как показано выше. Чтобы измерить площадь перекрытия, выполните следующие действия. Откройте исходный файл, содержащий изображения двух каналов, и выберите стеки изображений.

Разложите по изображениям, чтобы разделить его на два отдельных изображения. Используя плагин колокализации изображения J, выберите плагин колокализации и введите ранее записанные пороговые значения для A CHR и нервных каналов в соответствующее поле запроса канала. В результате получается перекрывающееся изображение в белых пикселях.

Преобразуйте вновь созданное изображение перекрытия в формат оттенков серого и примените пороговое значение к максимальному значению, при котором будут выбраны только белые пиксели, соответствующие области перекрытия двух предыдущих каналов. Запишите в таблицу полученную площадь значения колокализации, которая представляет собой площадь перекрытия в пикселях, подготовьте таблицу данных. Выборочные средства вычисляют и отображают стандартные отклонения и стандартные ошибки в виде гистограмм или диаграмм рассеяния.

Построение графиков и площадочных диаграмм A CHR в виде точечных диаграмм или частотных гистограмм для определения нормального распределения данных до статистической проверки. После подготовки иммунофлуоресцентного окрашивания и визуализации поперечных участков мышечных волокон, как указано в текстовом протоколе, откройте исходный файл изображения и во время просмотра канала A CHR выберите стеки изображений на изображения для разделения каналов выберите тип изображения восьми бит для преобразования восьмибитного формата оттенков серого на экран. Проделайте это для обоих флуоресцентных каналов.

Выберите стеки изображений для наложения и откройте новую стопку из двух ранее разделенных восьмибитных изображений, что позволяет переключаться между двумя каналами флуоресценции в одном окне с помощью инструмента полигона. Проведите линию плотно вокруг границы окрашивания A CHR, выберите «Измерить анализ», чтобы измерить среднюю интенсивность для A CHR в пределах закрытой области. Скопируйте это значение в таблицу с надписями, сохранив контур многоугольника.

Переключитесь на второй канал флуоресценции и выберите измерение анализа. Это даст среднее окрашивание для интересующего белка в пределах синаптической области, определенной окрашиванием A CHR. Выберите участок вдали от видимых пятен на торцевой пластине.

Затем выберите «Измерить анализ», чтобы измерить среднюю интенсивность фоновой флуоресценции. Повторите измерение для других флуоресцентных каналов и скопируйте фоновые значения в таблицу значений флуоресценции. Вычтите средние фоновые значения из значений торцевой пластины, чтобы получить скорректированные интенсивности для A CHR и интересующего белка на каждой торцевой пластине.

Наконец, разделите скорректированные значения интенсивности nplate для интересующего белка на скорректированную интенсивность флуоресценции BGT, чтобы получить отношения интенсивности флуоресценции, как показано здесь. Интенсивность флуоресценции как для A CHR, так и для синаптофизина резко возрастает на границе между синаптической и синаптической частями моторной концевой пластинки PERS. Для таких изображений минимальный порог позволит легко изолировать богатую A CHR или богатую синаптофизином область торцевой пластины.

Как показано на этом рисунке у старых мышей и при некоторых заболеваниях, окрашивание концевой пластины для синаптофизина может быть менее интенсивным. Края кластера A CHR могут казаться размытыми, и могут быть более высокие уровни экстрасинаптической автофлуоресценции. Тем не менее, средняя площадь A CHR на основе от 15 до 20 изображений лицевой торцевой пластины была одинаковой среди семи образцов мышей.

Фоновая флуоресценция низкой интенсивности, показанная здесь на канале синаптофизина, обычно показывает, представляет ли участок окрашивания A CHR одну концевую пластину или две отдельные торцевые пластины, расположенные на соседних мышечных волокнах. Кроме того, многие синаптические белки, такие как рапсон, мускус и бета-дистрогликан, локализованы вместе с CHR на nplate. При попытке использовать эту процедуру важно, чтобы экспериментаторы оставались слепыми к лечению и группам генотипов во время отбора проб и анализа изображений nplate.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как собирать, брать образцы и анализировать конфокальные флуоресцентные изображения нервно-мышечных соединений. В конечном счете, исследователи должны быть в состоянии последовательно и объективно сравнивать различные структурные параметры nplate среди различных групп лечения и генотипов.