Метод оценки воздействия диапазоне длин волн и интенсивностей красный / ближней инфракрасной световой терапии на окислительного стресса In Vitro
21 марта 2015 г.
Некогерентный ксеноновый свет пропускали через узкополосные интерференционные фильтры и фильтры нейтральной плотности, чтобы доставить свет различной длины волны и интенсивности к культивируемым клеткам. Этот протокол был использован для оценки влияния терапии красным/ближним инфракрасным светом на продукцию реактивных веществ in vitro: никаких эффектов при использовании тестируемых параметров не наблюдалось.
Общей целью данной процедуры является оценка влияния диапазона длин волн и интенсивностей терапии красным ближним инфракрасным светом на окислительный стресс in vitro. Для этого мы разработали новый метод подачи света, при котором мы можем манипулировать длиной волны и интенсивностью подаваемого света. Устанавливаем ксеноновый или широкополосный источник света в корпус на металлическую основу, затем размещаем перед светом линзу с покрытием, фильтр для воды и входную диафрагму.
Следующим этапом процедуры является проведение света, генерируемого широкополосным источником света, через вход, отверстие и жидкий световод, а также через вторую линзу с покрытием. Затем подгоняются фильтры полосы пропускания и нейтральной плотности для получения желаемой длины волны и интенсивности света. Обратите внимание, что фильтры позволяют пропускать узкий диапазон длин волн, называемый полосой волн.
Основное преимущество этой методики перед существующими методами проведения терапии красным ближним инфракрасным светом, такими как светодиоды или лазеры, заключается в том, что она позволяет точно и выверено манипулировать параметрами длины волны и интенсивности. Это позволяет нам оптимизировать доставку света для достижения наилучших биологических результатов, которые настоящее исследование применяет к диссоциированным клеткам. Кроме того, он также может быть применен к другим системам, таким как органотипические, модели нейротравмы.
При работе с любым ярким широкополосным источником света убедитесь, что вы не смотрите прямо на источник света, так как это может привести к необратимым повреждениям зрения. Чтобы подготовить устройство подачи света, подключите широкополосный источник света, такой как ксеноновая или вольфрамовая лампа, к соответствующему источнику питания. Расположите сортировочную линзу перед источником света, чтобы получить собранный луч света.
Пропустите свет через жидкостный тепловой фильтр, чтобы удалить большую часть тепла из светового луча. Расположите сортировочную линзу перед источником света, чтобы получить собранный луч света. Пропустите свет через жидкостный тепловой фильтр, чтобы удалить большую часть тепла от светового луча.
В зависимости от области применения, сфокусируйте собранный луч на входе жидкого световода для обеспечения более гибкой подачи света. На другом конце жидкого световода расположите вторую линзу с покрытием, а затем держатель для фильтров интерференции и нейтральной плотности. Такое расположение должно создавать равномерно освещенное световое пятно нужной полосы волн и интенсивности.
Расстояние между торцом световода и плоскостью образца может варьироваться в зависимости от освещаемой зоны. Важно помнить, что в соответствии с законом обратных квадратов, по мере увеличения расстояния от конца световода интенсивность света будет уменьшаться в данном исследовании. Это расстояние составляет 14 сантиметров, что приводит к получению поперечного сечения луча, которое равномерно освещает зону лунки три на три на 96-луночной тканевой культуральной пластине.
Убедитесь, что посторонний свет от лампы и связанных с ней оптических компонентов не может достичь других образцов, например, с помощью черного картона. После того, как устройство будет собрано, включите водяной охладитель для жидкостного теплового фильтра и убедитесь, что происходит обмен водой через рубашку фильтра. Включите источник питания лампы и подождите не менее пяти минут, пока не заработает широкополосный источник света.
Для стабилизации выберите узкополосный интерференционный фильтр, чтобы создать желаемую полосу волн освещения. Измерьте свет, излучаемый лампой, в плоскости, где должен быть установлен образец. Во время лечения.
Свет измеряется с помощью откалиброванного датчика излучения, подключенного к подходящему спектру. Радиометр. Используйте фильтры нейтральной плотности для регулировки интенсивности света до тех пор, пока не будет получен желаемый результат. В настоящем исследовании интенсивность света, проходящего через каждый интерференционный фильтр, регулируется таким образом, чтобы получить выходной сигнал одинакового качества в каждой из четырех полос волн Treatment.
Описанный метод доставки красной ближней инфракрасной светотерапии может быть применен к любому типу клеток или модельной системе in vitro. Здесь мы покажем нашу технику доставки света к клеткам с помощью феохромоцитомы или клеток PC 12. В качестве примера можно привести культивирование клеток в питательных средах.
В 96 лунках лотки покрывают полиоллизином до тех пор, пока они не сливаются на 70-80%. Приготовьте желаемую концентрацию глутамата или альтернативного стрессора в полноценных питательных средах. Здесь мы используем 10 миллимолярный глутамат.
Удалите среды из клеток и аккуратно промойте их трижды фосфатным буферным раствором. После промывки добавьте глутаматсодержащие среды в общем объеме сто Микролитров на лунку. Сразу после добавления глутамата или стрессора по выбору подвергните клетки световой обработке с желаемыми длинами волн и интенсивностью, поместив культуральную пластину под подготовленное устройство для доставки света.
Обязательно изменяйте качество выходного светового луча с помощью установленных комбинаций фильтров нейтральной плотности. В зависимости от длины волны, которую вводят. После завершения световой обработки поместите клетки на ровную поверхность и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в условиях регулируемого углекислого газа в течение 24 часов.
Также могут быть назначены дополнительные дозы терапии красным ближним инфракрасным светом. Перед проведением заключительного раунда световой обработки подготовьте реагенты, которые будут использоваться для обнаружения активных форм кислорода в качестве индикатора окислительного стресса. Здесь мы используем указанные диеты, которые флуоресцируют при реакции с рядом реактивных веществ, включая дилю, ацетат флуоресцеина D, проводят световую обработку клеток, как описано в четвертом шаге, обеспечивают обработку клеток желаемым гриппом и длинами волн света.
Сразу после обработки светом удалите глутаматсодержащую среду и дважды промойте PBS. Приступайте к анализу с использованием индикаторных красителей, которые флуоресцируют при реакции с реакционноспособными веществами в соответствии с инструкциями производителя. Измерьте флуоресценцию, генерируемую индикаторными красителями, с помощью планшетного ридера, настроенного на соответствующие настройки возбуждения и излучения.
Используйте цвет метрического набора для количественной оценки концентрации белка в лунках в соответствии с инструкциями производителя. Выразите выходные данные флуоресценции относительно концентрации белка для каждой отдельной скважины, а затем проанализируйте результаты с помощью статистического программного обеспечения. Разработка этой методики открывает путь для исследователей, изучающих влияние нескольких длин волн и интенсивностей терапии красным ближним инфракрасным светом на окислительный стресс.
Этот метод может быть использован в массиве модельных систем, включая диссоциированные клетки или органотипические культуры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается влияние терапии красным и ближним инфракрасным светом на окислительный стресс в культурах клеток. Был разработан новый метод подачи света с регулируемой длиной волны и интенсивностью для оценки его воздействия на выработку активных форм кислорода in vitro.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Фототерапия
Теоретическая часть
- Окислительный стресс является критическим фактором в различных биологических процессах.
- Светотерапия изучалась с точки зрения ее потенциальных терапевтических эффектов.
- Понимание влияния конкретных длин волн может расширить возможности терапевтического применения.
- Продукция активных форм кислорода является ключевым показателем окислительного стресса.
Цель исследования
- Оценка воздействия терапии красным и ближним инфракрасным светом на культивируемые клетки.
- Манипулирование параметрами света для проведения точной оценки.
- Вклад в понимание роли светотерапии в процессах окислительного стресса.
Используемые методы
- Использование источника ксенонового света, установленного на металлическом основании.
- Применение линз с покрытием и водяных фильтров для управления световым потоком.
- Использование входных апертур и жидкостных световодов для направления света.
- Применение узкополосных интерференционных фильтров и фильтров нейтральной плотности для достижения необходимых длин волн и интенсивности.
Основные результаты
- Значимого влияния на выработку активных форм кислорода не наблюдалось.
- Тестируемые параметры не оказали влияния на уровень окислительного стресса.
- Для определения эффективных условий светотерапии могут потребоваться дальнейшие исследования.
- Результаты способствуют пониманию ограничений светотерапии.
Выводы
- Терапия красным и ближним инфракрасным светом в протестированных условиях не повлияла на окислительный стресс.
- В будущих исследованиях следует изучить другие параметры для выявления потенциальных эффектов.
- Данная работа дополняет совокупность знаний о применении светотерапии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет проводить систематическую оценку параметров длины волны и интенсивности при светотерапии в красном и ближнем инфракрасном диапазонах для оптимизации зависимости «доза-эффект» при модуляции окислительного стресса in vitro. Благодаря использованию регулируемой платформы подачи света метод способствует механистическому снижению рисков при применении подходов фотобиомодуляции на ранних этапах исследований, особенно для моделей повреждений ЦНС, где окислительный стресс является ключевым патофизиологическим фактором. Возможность изоляции независимых переменных (длины волны, интенсивности) повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и разработке протоколов анализа.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы о параметрах света как модуляторах путей окислительного стресса.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет обеспечения точного контроля независимых переменных в исследованиях по фотобиомодуляции.
- Трансляционная ценность: облегчает определение оптимальных доз для снижения концентрации активных форм кислорода в релевантных для конкретных заболеваний моделях in vitro.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Обеспечивает получение валидированных биологических систем со стандартизированным световым воздействием для воспроизводимого анализа показателей окислительного стресса.
- Операционная ценность: Позволяет стандартизировать анализ за счет откалиброванной и равной подачи квантовой дозы на разных длинах волн.
- Трансляционная ценность: Создает платформы для высокопроизводительного скрининга фототерапевтических соединений или условий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Применимо к изолированным митохондриям или органотипическим культурам срезов для оценки влияния на окислительный метаболизм.
- Операционная ценность: Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет использования согласованных параметров подачи света.
- Трансляционная ценность: Помогает принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении исследования путем раннего определения неэффективных диапазонов параметров.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод применяется на ранних этапах поисковых исследований для проверки гипотез и уточнения сигнальных путей в исследованиях фотобиомодуляции, обладая при этом прямой практической ценностью при разработке анализов для измерения окислительного стресса.
- Биология открытий: способствует снижению рисков при изучении механизмов путем изоляции длины волны и интенсивности как переменных в путях окислительного стресса.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимой подачи света и количественного определения АФК с помощью DCFH-DA и красителей, чувствительных к H2O2.
- Аналитика: позволяет получать данные флуоресценции, нормированные по концентрации белка, что обеспечивает возможность сравнительного анализа различных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают связь с доклиническими моделями благодаря применимости к органотипическим культурам и митохондриальным системам.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многоразовая платформа для оптимизации доз фототерапии для различных моделей повреждений и типов клеток.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности при валидации мишеней за счет систематического скрининга параметров и устранения механистической неоднозначности в фотобиомодуляции.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость подачи света для обеспечения согласованности при оценке окислительного стресса in vitro.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки за счет раннего выявления неэффективных длин волн и интенсивностей, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Приоритизация фототерапевтических подходов с поправкой на риск на основе определенных зависимостей «параметр — отклик».
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области фотобиофизики и оптической калибровки для правильного подбора фильтров и нормализации интенсивности.
- Необходимы широкополосный источник света (ксеноновый/вольфрамовый), интерференционные фильтры, нейтральные светофильтры и оборудование для радиометрической калибровки.
- Требуется межгрупповая стандартизация между специалистами по биологии и биофизике для отчетности по длине волны и интенсивности.
- При адаптации метода следует учитывать различные форматы многолуночных планшетов, типы клеток и модели стрессоров, помимо клеток PC12, подвергнутых воздействию глутамата.
- Практическое ограничение: протестированные значения плотности энергии (8.5 x 10-3 – 3.8 x 10-1 J/cm2) не модулировали уровень ROS в данной системе, что указывает на необходимость расширения диапазона параметров в других моделях.
