Питательные Регулирование непрерывной подачи для крупномасштабного Расширение клеток млекопитающих в сфероидов

Общая цель этого процесса заключается в культивировании большого количества клеток в контролируемых питательных условиях. С помощью обычного оборудования, которое можно найти в лаборатории клеточных культур. Связанные с ними алгоритмы позволяют контролировать и манипулировать питательными веществами в экспериментальных диапазонах.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы для крупномасштабных применений в клеточных культурах. Например, клеточная терапия человека. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет культивировать клетки в больших масштабах с равномерным распределением питательных веществ и газов.

Это обеспечивает более высокую плотность клеток по сравнению со статическими или массовыми культурами клеток, увеличивает выход и снижает потерю клеток. Это можно сделать с помощью оборудования, которое обычно используется в большинстве лабораторий по выращиванию клеток. Визуальная демонстрация этого метода может быть полезна для новых исследователей, поскольку используемые методы могут быть трудными для освоения из-за большого количества шагов, которые должны быть выполнены в определенном порядке в стерильных условиях.

Соберите пять основных компонентов, необходимых для системы кормления. Резервуар для среды, перистальтический насос, биореактор с перемешиванием, резервуар для отходов и специально разработанный комплект для отбора проб трубок. Установите средний резервуар с помощью литровой стеклянной бутылки.

Резервуар для отходов используется с помощью двухлитровой стеклянной бутылки. Биореактор с перемешиванием с использованием стеклянного реактора объемом 250 мл. Используйте цифровой перистальтический насос или аналогичный насос с восьмиканальной головкой для управления заменой среды.

Соберите резервуар и модифицированные крышки биореактора из твердого и автоклавируемого пластика. Со сквозными отверстиями для труб из нержавеющей стали для обеспечения вентиляции через стерильные фильтры и обеспечения перекачки среды между резервуарами и биореакторами. Прикрепите к крышке модифицированного биореактора с перемешиванием суспензии выпускную трубку, изготовленную из аэрационных трубок из пористого стекла.

Соберите автоклавируемые комплекты перфузионных трубок из соединителей трубок из поливинилиденфторида и прочных перистальтических трубок насоса. Длина секции зависит от расстояния между различными компонентами. Соберите подающую линию, используя трубки двух диаметров.

Используйте L/S 14 для первичной трубки, которая будет проходить на расстоянии от биореактора до резервуара для среды. Вставьте трубку длиной L/S 13 в середину длины трубки для насосной секции, используя соответствующие адаптеры PVDF. Используйте стандартные переходники трубок из ПВДФ с заусеницами для соединения двух частей трубки L/S 14 с обеих сторон более короткой трубки насосной секции.

Соберите секцию трубки для удаления отходов с помощью трубки L/S 16 большего диаметра и вставьте короткую секцию трубки L/S 14 в середину для насосной секции. Это делается так же, как и сборка питающей линии с использованием адаптеров со шлангами из ПВДФ. Соберите последний компонент набора трубок, собрав набор из трех коротких трубок длины L/S 14

Соединен вместе с помощью Т-образного разъема HVDF и двух небольших хомутов для шланга на двух отрезках трубки. Подсоедините сборку образцов к разъему для образца из нержавеющей стали, прикрепленному к крышке биореактора. После стерилизации будет прикреплен стерильный газовый фильтр для отвода газа на одну из зажимных длин.

Другой используется для подключения к стерильному шприцу для отбора проб. Автоклавируйте сборку для отбора проб, пока она подключена к биореактору, до начала эксперимента, как описано в текстовом протоколе. Используйте эту сборку для сбора стерильных образцов из биореактора по мере необходимости, не нарушая непрерывный процесс подачи.

Прикрепите стерильные вентиляционные отверстия в соответствующих местах на крышках колбы, сосуде для среды, емкостях для отходов и отверстиях для отбора проб. Культивируйте и собирайте клетки, как описано в текстовом протоколе. Дайте клеткам инкубироваться при комнатной температуре в трипсине в течение двух-трех минут в шкафу биобезопасности, а затем соберите их в коническую трубку.

Затем отбирают небольшой образец клеток и окрашивают его трипановым синим. Подсчитайте плотность клеток с помощью микроскопа и стандартного гемоцитометра с окрашиванием трипановым синим, как описано в текстовом протоколе. Добавьте желаемое общее количество клеток в стерильные биореакторы с перемешиванием суспензии для каждого состояния.

Добавьте среду в биореактор с перемешанной суспензией с помощью пипетки до достижения желаемого общего объема культуры. Переместите биореактор с перемешиванием суспензии с клетками на перемешивающую пластину внутри инкубатора для клеточных культур. Культивирование клеток в биореакторах без кормления в течение трех дней при температуре 37 градусов Цельсия, с 5% углекислого газа, 100% относительной влажности и скоростью перемешивания 70 об/мин для образования сфероидов.

После формирования сфероида извлеките перемешанный биореактор из инкубатора. Соберите компоненты для системы непрерывного кормления в шкафу биологической безопасности. Сначала заполните резервуар для свежей среды нужной питательной средой, а затем подключите к одной стороне линии подачи.

Также убедитесь, что резервуар для свежей среды правильно вентилирован с помощью стерильного фильтра. На входном отверстии биореактора следует заменить стерильный фильтр для фильтрации среды перед ее поступлением в биореактор. Подсоедините сливной трубопровод к резервуару для средних отходов и убедитесь, что резервуар для отходов правильно вентилируется с помощью стерильного фильтра.

Поместите биореактор с перемешиванием суспензии на перемешивающую пластину внутри инкубатора, используя те же параметры культуры, что и для формирования сфероидов. Поставьте свежий средний резервуар в ближайший мини-холодильник. Убедитесь, что линии подачи имеют возможность выходить из холодильника, не препятствуя закрытию дверей.

Также важно, чтобы линии кормления не были зажаты, закрыты дверцами ни холодильника, ни инкубатора. Резервуар для отработанной среды можно поставить на столешницу за пределами инкубатора в удобном месте. Пропустите оставшиеся концы трубок в инкубатор и подсоедините подающий трубопровод к фильтру на входном отверстии биореактора.

Затем подсоедините сливную линию к отверстию выпускной трубки. Затем поместите насосную секцию подающего и сточного трубопроводов в головку насоса, обеспечив правильную ориентацию, чтобы подающие трубопроводы перекачивали среду из резервуара со свежей средой в биореактор с перемешиванием суспензии, а трубопроводы отходов перекачивали среду из биореактора и в резервуар для отработанной среды. Рассчитайте скорость подачи с помощью скорректированного уравнения скорости подачи, как описано в текстовом протоколе.

Используйте самый последний образец с информацией о количестве клеток, а также прогноз скорости роста и измерения уровня глюкозы в среде, чтобы оценить скорость подачи, необходимую для поддержания желаемой концентрации глюкозы в культуре. Установите скорость насоса на основе рассчитанной скорости подачи. Повторите расчет скорости подачи и отрегулируйте скорость насоса для каждой точки отбора проб.

Измерения уровня глюкозы в средах получены из сфероидных культур инсулиномы Beta-TC6 с использованием статических биореакторов с перемешиванием суспензии и методов непрерывной подачи биореакторов с перемешиванием суспензии. Кормление стандартной средой с высоким содержанием глюкозы. Непрерывное кормление способно устранить колебания уровня глюкозы, но средний уровень глюкозы в среде резко меняется в течение периода культивирования и значительно превышает физиологический диапазон.

Скорректированное кормление способно устранить колебания, а также поддерживать концентрацию глюкозы вблизи физиологических уровней в течение всего периода культивирования. Здесь сравнивается рост клеток, представленный как кратное изменение числа клеток в течение 21-дневного периода культивирования, для биореакторов с перемешиванием суспензии с регулярной сменой среды, постоянной скоростью подачи биореакторов с перемешиванием суспензий и скорректированной скоростью подачи культур биореакторов с перемешиванием суспензий. После этой процедуры могут быть разработаны другие методы, такие как изменение условий, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как потребности в питательных веществах для новых клеточных линий или конкретные экспериментальные результаты.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению метаболических потребностей в клетках человека с раком или другими заболеваниями. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собрать систему обильных клеточных культур, чтобы лучше контролировать условия культивирования и максимизировать выход клеток. Не забывайте, что работа с клетками человека может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как защита от патогенов, передающихся через кровь.