Быстрое Фракционирование и выделение целых компонентов крови в образцах, полученных из Окружение сообщества, основанного

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить оптимизированный протокол, который обеспечивает быструю пропускную способность глаз и одновременную обработку образцов цельной крови. В неклинических условиях обработка вакутаайзера выполняется перекрывающимся образом, чтобы обеспечить эффективное выделение высококачественных фракций мононуклеарных клеток периферической крови D-N-A-R-N-A или сыворотки pbmc и остаточных фракций плазмы и эритроцитов. Обработка начинается с центрифугирования сывороточного вакутайнера, удаления аликвоты из одного флаконного вакутейнера для выделения ДНК, центрифугирования флаконных пробирок.

Затем может произойти завершение выделения ДНК после выделения ДНК лейкоцитарной РНК из вакутейнера K two EDTA. Кровь из каждого вакутайнера пропускают через соответствующий фильтр и промывают PBS, а затем обрабатывают стабилизирующим агентом РНК, возвращающимся в флакон, содержащий вакутайнер. Остаточная плазма оттягивается, а моноядерный слой промывается PBS.

Пока трубки вращаются, остаточные эритроциты собираются, и отделенная сыворотка является аликвотой. Наконец, pbmc сохраняют в среде для замораживания клеток. В конечном счете, высококачественные фракции свежей крови могут быть получены в течение двух часов после сбора, а все готовые к анализу образцы могут быть доступны в течение двух дней.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что процедуры могут быть выполнены одновременно в неклинических условиях, таким образом, в течение двух дней получается исходный материал для множества последующих применений, включая микрочиповый эпигенетический анализ в реальном времени R-T-P-C-R и анализ проточной цитометрии. Демонстрировать процедуру будет Эми Векл, руководитель моей лаборатории, чтобы начать обработку образцов цельной крови. Убедитесь, что буферы, центрифуга и тепловой блок подготовлены.

Задокументируйте время доставки пылесоса на листе отслеживания образцов. После получения образцов задокументируйте изоляцию сыворотки. Время запуска на бревне образца немедленно начните обработку путем центрифугирования семимиллилитрового вакутенера сыворотки с выключенным тормозом и ускорением.

Использование качающегося ротора ковша с аэрозольными колпачками в течение 20 минут при 1300 GS четырех градусах Цельсия во время центрифугирования вакуумера сыворотки. Задокументируйте время начала выделения ДНК в капюшоне BSL для двух клеточных культур. Переверните вакуумные контейнеры, содержащие гель для флакона, пять раз и добавьте 200 микролитров цельной крови с верхней части одного из вакутенеров в каждую из двух 20-микролитровых аликвот протеазы.

Оставьте пробирки для микроцентрифуги для протеазы и крови в колпаке и продолжайте центрифугирование вакуумных контейнеров, содержащих жидкость. Перед центрифугированием. Задокументируйте время начала изоляции PBMC, которое должно быть в течение двух часов после забора крови.

Инвертируйте вызов FI, содержащий вакуумные контейнеры, уже находящиеся в аэрозоленепроницаемых контейнерах, от восьми до 10 раз. Затем центрифугируйте вакуумер с выключенным тормозом и ускорением в течение 30 минут при 1600 Gs 22 градуса Цельсия. Вернитесь к образцам для выделения ДНК в колпак и добавьте по 200 микролитров буферного алюминия в каждую из протеаз и микроцентрифужную пробирку для крови.

Закройте трубки крышками и снимите их с колпака. Затем сделайте их вихревыми в течение 15 секунд. После вортекса сразу же вспыхивают, закручиваем образцы.

Продолжайте выделение ДНК, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, до тех пор, пока ДНК не будет упомянута в столбце по Эллуциану. Объединена ДНК из двух колонок для каждого участника, что дало общий выход 800 микролитров на участника. Задокументируйте время начала выделения лейкоцитарной РНК.

Проткните резиновую перегородку вакутайнера K two EDTA с помощью передаточного шипа. Сохраните оболочку и завинчивающуюся крышку для последующего использования после сборки системы трубок K two EDTA. Используйте конец металлического шпателя, чтобы безопасно разжать иглу и ввести иглу в пустую пробирку для вакуумированного сбора крови объемом 10 миллилитров.

Переверните ресивер трубки вакутайнерного фильтра K two EDTA, чтобы завершить настройку После фильтрации и промывки PBS извлеките три миллилитра стабилизатора РНК с помощью нового шприца объемом 10 миллилитров. Промойте фильтр, убедившись, что стабилизатор РНК остается прикрепленным. Затем отсоедините шприц от фильтра, не втягивая поршень.

Загерметизируйте вход и выход фильтра оболочкой и завинчивающейся крышкой, оставшимися от передаточного шипа, и оставьте фильтр насыщенным стабилизатором РНК. Храните фильтр при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее двух часов, пока не позволит время для завершения изоляции РА. После того, как вакутейнер вернется в колпак BSL two, снимите пробку и с помощью серологической пипетки удалите 1,5 миллилитра верхнего слоя плазмы, не приближаясь к моноядерному слою.

Переложите плазму из двух вакутайнеров в пятимиллилитровый криопробирку. Затем зарегистрируйте собранный объем. Оставшуюся плазму и моноядерный слой перенесите с помощью серологической пипетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Затем добавьте достаточно одного заранее подготовленного XPBS, чтобы довести общий объем в конической трубке до 15 миллилитров. Закройте трубку крышкой и переверните ее пять раз. Затем центрифугируйте пробирку с выключенным тормозом и ускорением в течение 15 минут при 300 GS 22 градуса Цельсия.

Вернитесь к флакону, содержащему вакуумные контейнеры в капюшоне, и соберите эритроциты или эритроциты. Используйте пипетку для пипетки размером пять и три четверти дюйма, чтобы покрутить и ослабить внешний слой геля флакона и удалить его. Используйте серологическую пипетку для сбора и переноса эритроцитов в пятимиллилитровый криопробирку.

Затем зарегистрируйте громкость. Затем перенесите криопробирки с плазмой и эритроцитами в контейнер для заморозки с контролируемой скоростью и храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее 24 часов. Через 24 часа переложите образцы в криобокс и верните их при температуре минус 80 градусов Цельсия для длительного хранения.

Когда центрифугирование будет завершено, верните коническую трубку в колпак и отасуньте жидкость, оставив 500 микролитров PBS, не нарушая гранулу. Добавьте один XPBS, чтобы довести объем до 10 миллилитров и повторно суспендируйте гранулу. Аккуратно закройте трубку крышкой и переверните ее пять раз.

Затем центрифугируйте образец с выключенным тормозом и ускорением в течение 10 минут при 300 GS 22 градуса Цельсия. После центрифугирования распределите верхний слой сыворотки из вакууматора в два миллилитровых криофлана и задокументируйте объем. Используйте четыре криофлакона и добавьте 200 микролитров в криопробирку.

Один 1000 микролитров в криофлакон два. Затем разделите оставшийся объем на третий и четвертый криофлаконы. Переложите криофлаконы в криобокс и держите их при температуре минус 80 градусов Цельсия для длительного хранения.

И задокументируйте время запуска морозильной камеры. Продолжайте изоляцию PBMC. Возвращая образцы в колпак после центрифугирования, аспирируйте как можно больше надосадочной жидкости, не нарушая гранулу.

Суспензируем гранулу в 2,5 миллилитрах ПМЦ. Средний. Добавьте 2,5 миллилитра PBMC, замораживающую среду две содержащие ДМСО и РПМИ.

Средоточьте до заранее приготовленного клеточного раствора, и аккуратно обведите образец вихрем. Затем аликвотируйте 10 микролитров клеточного раствора в микроцентрифужную пробирку. Добавьте 10 микролитров 0,4%-ного синего пятна в микроцентрифугу и перемешайте раствор с помощью пипетирования несколько раз.

Далее пипеткой нанесите 10 микролитров смеси в камеру для подсчета клеток. Сдвиньте предметное стекло и поместите его в счетчик ячеек в течение трех минут после смешивания. Увеличьте масштаб и сосредоточьтесь на клетках.

Затем выберите подсчет ячеек, чтобы получить подсчет A-P-B-M-C. Если жизнеспособное число PBMC превышает 3 миллиона клеток на миллилитр, распределите образец максимум в пять криопробирок с концентрацией не менее 3 миллионов клеток на миллилитр. Каждый из них документирует количество клеток в криопробирке в журнале образцов.

Смотрите сопроводительный текстовый протокол о том, как действовать, если жизнеспособное число PBMC ниже 3 миллионов клеток на миллилитр. Наконец, переложите криопробирки в контейнер для заморозки с контролируемой скоростью и поместите их при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее чем на 24 часа. Через 24 часа переложите криопробирки в криобокс и поместите бокс в паровую фазу резервуара с жидким азотом для длительного хранения.

Запишите время запуска морозильной камеры в журнале образцов. Методы выделения лейкоцитарной РНК и обработки фильтров позволили получить изображение геля в результате капиллярного электрофореза. Были получены две отдельные полосы с минимальной деградацией, представляющие АТТ s и 28 s рибосомальную РНК.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что поддержание точности записей имеет решающее значение. Мы рекомендуем разработать базу данных для хранения всей информации о криофлаконах, включая объем, концентрацию, качество, штрих-код и место хранения с самого начала. А дальнейшие рекомендации по организации выборки можно найти в текстовом протоколе.