Генерация плазмидных векторов выражая флага меченных белков соответствии с Положением удлинения Человеческий фактор-1α промотора, используя Gibson Ассамблею
9 февраля 2015 г.
Синтез пользовательских плазмид требует труда и времени. Этот протокол описывает использование клонирования сборки Gibson для сокращения работы и продолжительности процедуры пользовательского клонирования ДНК. Описанный протокол также позволяет создавать надежные меченые белковые конструкции для экспрессии у млекопитающих по цене, аналогичной традиционному клонированию ДНК методом вырезания и вставки.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы использовать метод сборки Гибсона для создания больших и сложных конструкций ДНК, объединяющих короткие и длинные сегменты из нескольких различных источников ДНК. Сначала вычислительно спроектируйте полную нуклеотидную последовательность плазмид, а затем спроектируйте перекрывающиеся наборы праймеров. Далее матрицы ДНК для реакции сборки амплифицируются методом ПЦР.
Далее проводится очистка продуктов ПЦР. Заключительным этапом является реакция сборки полученных плазмид и верификация клонов плазмид. В конечном счете, реакция сборки Гибсона используется для получения параллельных плазмид, содержащих помеченные флагами версии дикого типа и мутантные белки CSTF 64 в рамках транскрипционной регуляции человеческого фактора удлинения 1 альфа.
Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как традиционный DNA Corning, заключается в том, что она позволяет создавать параллельно, схожие по дизайну, дикие типы и мутантные плазмиды без последовательных этапов Corning. Спроектируйте непрерывную нуклеотидную последовательность, представляющую конечную плазмиду. Теперь перечислите реальные плазмиды и фрагменты ДНК, которые будут использоваться в качестве шаблонов в порядке ПЦР, фрагменты ДНК, которые не всегда доступны, такие как различные комбинации меток и промоторов в виде одиночных или множественных синтетических двухцепочечных фрагментов ДНК.
Далее разделите непрерывную нуклеотидную последовательность итоговой конструкции на фрагменты ДНК, пригодные для ПЦР. Убедитесь, что фрагменты совпадают с доступными плазмидами и фрагментами синтетической ДНК. Избегайте фрагментов ДНК размером менее 200 нуклеотидов.
Рядом с доступом к инструменту создания грунтовки выберите меню «Установить настройки» во всплывающем окне «Изменение настроек сборки Gibson». Выберите вкладку «Изменить преды», затем выберите меню «Построить конструкцию», чтобы вставить разделенные фрагменты ДНК в инструмент генерации праймеров последовательно от пяти простых до трех простых концов. Откройте окно ввода вектора или вставки фрагмента, вставьте первый фрагмент ДНК, представляющий пять простых концов векторной ДНК в быстром формате А, и назовите этот фрагмент ДНК.
Выберите подходящий способ получения фрагмента ДНК. Затем нажмите на вкладку «Продолжить». Если есть необходимость добавить дополнительные нуклеотиды или сайты рестрикции на стыке конечной конструкции, то откройте окно добавления и вставки фрагмента в области сборки в области прямого или обратного праймерного спейсера.
Введите дополнительные нуклеотиды или сайты рестрикции только к одному из фрагментов ДНК. Затем нажмите на вкладку «Готово». Повторяйте для всех фрагментов, пока конструкция не будет завершена.
Выберите меню просмотра праймеров и просмотрите последовательности праймеров. Также повторите для всех конструкций, вектора, магистралей и вставок или для фрагментов ДНК, которые отличаются. Разбавьте праймеры ПЦР до 10 микромоляров в воде или буфере.
Затем разбавьте все матрицы ДНК и одноцепочечные синтетические ДНК для ПЦР до одного нанограмма на микролитр в воде. Соберите ПЦР-реакции при комнатной температуре, соединив 2,5 микролитра по 10 микромоляров каждого праймера. Один микролитр из одного нанограмма на микролитр матричного фрагмента ДНК составляет 25 микролитров горячего.
Начните с корректуры ДНК-полимеразы и 19 микролитров воды. Перемешайте пробирку легким движением и соберите капли жидкости путем кратковременного центрифугирования. Амплигируйте одновременно в отдельных пробирках фрагменты ДНК аналогичного размера в соответствии с рекомендациями для используемой ДНК-полимеразы.
Проведите от 25 до 28 циклов ПЦР или определите количество циклов, которые дают достаточный выход ДНК. Разрешите пять микролитров ПЦР с помощью стандартного гель-электрофореза AROS. Убедитесь, что видна одна полоса ДНК, представляющая продукт ПЦР.
Определить размер и относительное количество фрагментов ДНК с помощью стандартов молекулярной массы ДНК, при необходимости повторить ПЦР для получения достаточного количества фрагментов ДНК. Перенесите предварительно переваренные с помощью ДПН одну пробирку на 1,5 миллилитра и добавьте в каждую пробирку по 81 микролитру магнитных шариков для очистки ДНК. Выдержать смесь при комнатной температуре в течение 10 минут.
Поместите трубки на магнитный коллектор на две минуты. Теперь выбросьте прозрачную жидкость. Дважды умойтесь 200 микролитрами 80%-ного этанола в течение 30 секунд.
Затем суспендируйте высушенные бусины в 10 микролитрах 10 миллимоляров трис гидрохлорида pH 8,0 Через две минуты кратковременно открутите, а затем поместите трубки на магнитный коллектор на две минуты. Удалите от 8,5 до 10 микролитров прозрачного раствора и поместите его в новую предварительно помеченную пробирку. Определение концентрации фрагментов ДНК методом УФ-спектроскопии.
Используйте не менее 100 нанограммов фрагмента ДНК, представляющего основу вектора или фрагмент ДНК, несущий селективный маркер. Рассчитайте трехкратный избыток моляров для фрагментов ДНК, которые будут использоваться в качестве вставок. Смешайте рассчитанное количество фрагментов ДНК в ПЦР-пробирке.
Затем отрегулируйте объем до 10 микролитров. Добавьте 10 микролитров сборочной мастер-смеси Gibson. Инкубируйте реакцию при температуре 50 градусов Цельсия в термоциклере для ПЦР.
Приступайте к преобразованию сборочного продукта в некомпетентную кишечную палочку, или заморозьте изделия при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся. Следуйте процедуре трансформации, которая сопровождает химические или электрокомпетентные клетки. Обычно используют два микролитра реакции сборки на одну реакцию превращения.
Наконец, подтвердите успешность клонирования ДНК с помощью секвенирования ДНК с использованием специфических или стандартных праймеров. Проанализируйте данные секвенирования на предмет точности. Этот эксперимент был разработан для клонирования фактора стимуляции расщепления белка 64, а также мутантного CSTF 64.
Белки сливались в метку с тремя x флагами в соответствии с экспрессивной регуляцией промотора HE F1 альфа. Плазмида, содержащая альфа-HE F1 с последующей меткой с тремя х-флажками, была нам недоступна. Тем не менее, были доступны следующие плазмиды.
ДНК ПК 3,1 М шипит HF одна альфа-содержащая плазмида и мышиная CSTF 64 плазмиды. Вся последовательность для конструкта была собрана с помощью нуклеотидных приложений и приложений для редактирования текста. Впоследствии последовательность была разделена на четыре удобных участка, соответствующих имеющимся плазмидным ДНК.
Четыре фрагмента ДНК для реакций сборки амплифицировали с помощью ПЦР. Полученные плазмиды из отдельных клонов амплифицировали и анализировали с помощью фермента рестрикции для правильной сборки в вектор ДНК pc. Затем клоны Select были проверены с помощью секвенирования. После освоения техники сборки, включая плазмидный и первичный дизайн, последующая ПЦР и комм-верификация могут быть выполнены в течение пяти дней, не считая времени на синтез и доставку первичной и синтетической ДНК.
Обзор
В данном протоколе описывается использование метода клонирования путем сборки по Гибсону (Gibson assembly) для оптимизации синтеза специализированных плазмид, что значительно сокращает временные и трудозатраты на клонирование ДНК. Этот метод позволяет создавать надежные конструкции белков с метками для экспрессии в клетках млекопитающих при затратах, сопоставимых с традиционными методами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Молекулярная биология
- Генная инженерия
- Экспрессия белков
Обзор
- Синтез заказных плазмид традиционно требует больших трудозатрат.
- Сборка по Гибсону позволяет создавать плазмиды параллельно.
- Белки с метками необходимы для изучения функций белков.
- Эффективные методы клонирования имеют решающее значение для генетических исследований.
Цель исследования
- Для упрощения процесса создания сложных конструкций ДНК.
- Для одновременного получения плазмид дикого типа и мутантных плазмид.
- Для повышения эффективности сборки плазмид для экспрессии в клетках млекопитающих.
Используемые методы
- Разработка перекрывающихся наборов праймеров для сборки ДНК.
- Амплификация матриц ДНК с помощью ПЦР.
- Очистка продуктов ПЦР перед сборкой.
- Трансформация компетентных клеток E. coli собранными плазмидами.
Основные результаты
- Успешная сборка плазмид, содержащих белки CSTF 64 с флаг-тегом.
- Верификация плазмидных конструктов с помощью секвенирования.
- Демонстрация преимуществ параллельной сборки перед традиционными методами.
- Получение конструктов под регуляцией промотора фактора элонгации 1-альфа человека.
Выводы
- Метод сборки Гибсона значительно сокращает время клонирования.
- Он позволяет эффективно создавать конструкции белков с метками.
- Данный подход может быть применен в различных проектах по генной инженерии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Быстрое параллельное создание специализированных плазмидных векторов с помощью сборки по Гибсону позволяет эффективно получать конструкции меченых белков для функциональных исследований в системах млекопитающих. Данный подход устраняет проблему стабильности экспрессии под управлением промоторов и доступности конструкций, поддерживая рабочие процессы на этапах раннего поиска и валидации мишеней. Этот метод повышает достоверность прогнозов и ускоряет сортировку портфеля за счет сокращения циклов клонирования и повышения надежности конструкций.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность быстрого изучения функции генов с помощью настраиваемых экспрессионных конструкций.
- Облегчает механическое снижение рисков за счет поддержки параллельных исследований белков дикого типа и мутантных белков.
- Повышает прогностическую достоверность валидации мишени, обеспечивая стабильную экспрессию генов в моделях стволовых клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные экспрессионные векторы для последующего проведения фенотипического или биохимического анализа.
- Способствует стандартизации анализа, обеспечивая воспроизводимое создание конструктов с определенными метками и промоторами.
- Ускоряет подготовку к скринингу за счет сокращения сроков сборки конструктов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает соответствие дизайна конструкции системам, релевантным заболеванию, за счет возможности экспрессии в стволовых клетках млекопитающих.
- Поддерживает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации благодаря стабильной экспрессии под управлением промотора.
- Снижает риск потери экспрессии, что при необходимости способствует проведению трансляционных исследований биомаркеров.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод на основе сборки по Гибсону применяется на ранних этапах поиска и разработки анализов, обеспечивая переход от проектирования конструкта к функциональной валидации в системах млекопитающих.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей за счет обеспечения возможности быстрого создания конструктов для изучения функций генов.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых плазмид, готовых к анализу и обладающих потенциалом количественного выхода.
- Аналитика: предоставляет конструкты с подтвержденной последовательностью, что позволяет надежно сравнивать эффекты белков дикого типа и мутантных белков.
- Трансляционные исследования: облегчает экспрессию в моделях стволовых клеток, релевантных для конкретных заболеваний, поддерживая преклиническую преемственность.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемый и многократно используемый рабочий процесс для будущих потребностей в конструктах в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и уменьшает механистическую неопределенность при изучении функций генов.
- Операционная ценность: Стандартизирует и ускоряет создание конструктов с высокой воспроизводимостью.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более быстрое принятие решений о целесообразности дальнейших разработок и повышает эффективность использования капитала за счет сокращения циклов клонирования.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение валидированных мишеней.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области компьютерного дизайна последовательностей и использования инструментов для генерации праймеров.
- Необходим доступ к оборудованию для ПЦР, очистки ДНК и секвенирования.
- Требуется межкомандная стандартизация этапов дизайна и верификации конструктов.
- Метод адаптируем к различным модельным системам при соответствующем подборе промотора и метки.
- Результат зависит от наличия матричных ДНК и сроков поставки синтетических фрагментов ДНК.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
In Silico Design: Final Plasmid and Overlapping Primers
3:58
Amplification of the DNA Fragments
5:44
DNA Purification Using Magnetic Beads
6:58
Assembly Cloning Reaction and Transformation of the Products in E. coli
8:21
Results: Cloning of CstF-54 and CstF-64 Mutants Under the Transcriptional Regulation of Human Elongation Factor 1α Promoter
9:47
Conclusion
