Проточной цитометрии протоколы для поверхностных и внутриклеточных антиген анализ нейронных типов клеток

Общая цель данной процедуры заключается в анализе экспрессии поверхностных и внутриклеточных антигенов на нервных клетках с помощью проточной цитометрии. Это достигается путем предварительного забора нервных клеток либо из культур in vitro, либо из первичной нервной ткани. Далее на клетки наносится необязательное неспецифическое внутриклеточное окрашивание.

Затем желаемые поверхностные антигены немедленно мечутся первичным антителом, тогда как желаемые внутриклеточные антигены помечаются после клеточной фиксации и проникновения. В конечном счете, результаты могут быть получены с помощью проточного цитометрического анализа для совместной экспрессии поверхностных антигенов на конкретных нервных субпопуляциях, представляющих интерес, как это определено внутриклеточной меткой. В этом протоколе будет показано, как получить полученные из культуры тканей нервные клетки для исследования поверхностных и внутриклеточных антигенов с помощью многоцветной проточной цитометрии.

Для начала сбора адгезивных нервных клеток выращивают в колбах с Т 75, сначала аккуратно промыв клетки пятью миллилитрами магния и кальция PBS при комнатной температуре. Затем отделите клетки от колбы, добавив три миллилитра заменителя трипсина, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-пяти минут. Утолите ферментативное расщепление, добавив шесть миллилитров проточного буфера после ослабления клеточных комков, пипетируя клеточную суспензию вверх и вниз несколько раз, перелейте всю клеточную суспензию в свежую 15-миллилитровую пробирку для изоляции клеток.

Поместите пробирку в центрифугу, раскрутите клетки в течение пяти минут при комнатной температуре и аспирируйте снат, готовясь к внутриклеточному мечению красителем. Повторно суспендируйте клеточную гранулу пятью миллилитрами PBS плюс 0,1% BSA. В противном случае добавьте пять миллилитров буфера для потока в сочетании со стандартным протоколом окрашивания триана синим.

Используйте гемоцитометр для оценки эффективного количества жизнеспособных клеток. Отрегулируйте концентрацию клеток существующей суспензии до 1 миллиона жизнеспособных клеток на миллилитр с тем же буфером, который использовался на предыдущем этапе. Теперь эти клетки готовы к двум вариантам окрашивания: окрашиванию поверхностными антигенными антителами или дополнительному флуоресцентному внутриклеточному окрашиванию карбоксифлуоресцеином с последующим вышеупомянутым поверхностным окрашиванием антигеном.

Для выполнения этапа внутриклеточного мечения с помощью красителя на основе эфира карбокси флуоресцеина CIN сначала добавляют 10 микролитров стокового раствора CFSE. На каждый миллилитр клеточной суспензии поместите трубку на шейкер при 200 оборотах в минуту и выдержите смесь в течение пяти минут. При комнатной температуре не допускайте фотообесцвечивания, защищая трубку от прямого воздействия света.

Утолите все нереактивные красители, добавив пять объемов сыворотки, содержащей буфер для потока, и осторожно вверх и вниз несколько раз перемешайте. Затем раскрутите клетки в течение пяти минут в центрифуге комнатной температуры и отасуньте надосадочную жидкость, чтобы удалить остаточные следы нереактивных красителей. Промойте клеточную гранулу с помощью реверсуса, суспензив ее пятью объемами буфера потока.

Затем клетки снова вращают в центрифуге комнатной температуры в течение пяти минут, прежде чем отбросить натанта SUP. Наконец, повторно суспендируйте клеточную гранулу буфером потока таким образом, чтобы конечная концентрация клеток составляла 1 миллион жизнеспособных клеток на миллилитр. Для мультиплексного эксперимента добавьте равное количество неокрашенных клеток из других экспериментальных условий в суспензию окрашенных клеток CFSC.

Теперь клетки готовы к мечению поверхностных антигенов антителами, чтобы начать окрашивание поверхности клеток. Переложите 100 микролитров клеточной суспензии с этикеткой CFSC или без нее в свежую 1,5-миллилитровую пробирку. Добавьте в клеточную суспензию конъюгированные фторсодержащие четыре антитела в количестве, предварительно определенном с помощью тестов на титрование антител.

Поместите пробирку на орбитальный шейкер комнатной температуры при 100 оборотах в минуту и выдерживайте смесь в течение 30 минут. При отсутствии света разведите смесь антител, добавив один миллилитр проточного буфера. Аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать и раскрутить клетки в предварительно охлажденной микроцентрифуге с температурой 4 градуса Цельсия в течение четырех минут.

Аспирируйте супинат, чтобы удалить несвязанные антитела, и повторите эту промывку центрифугой и аспирацией. Сделайте еще один шаг. Реус суспендирует клеточную гранулу в 100 микролитрах в буфере потока к ранее окрашенным клеткам.

Добавьте 500 микролитров фиксирующего буфера в 100 микролитров клеточной суспензии. Поместите пробирку на орбитальный шейкер комнатной температуры при 100 оборотах в минуту и инкубируйте в течение 15 минут в темноте. Формальдегид будет сшивать все виды белков и ДНК, которые находятся в непосредственной близости друг от друга, и давать нежизнеспособные клеточные суспензии.

Разбавьте фиксирующую смесь, добавив один миллилитр PBS, и аккуратно пипеткой вверх и вниз несколько раз перемешайте. Затем раскрутите неподвижные элементы в предварительно охлажденной центрифуге с температурой четыре градуса Цельсия в течение трех минут. Аспирируйте супинат таким образом, чтобы 100 микролитров жидкости оставалось над клеточной гранулой, чтобы проникнуть через клеточную мембрану для последующего внутриклеточного мечения антигеном.

Добавьте 500 микролитров проникающего буфера в 100 микролитров клеточной суспензии. Поместите пробирку на орбитальный шейкер комнатной температуры при 100 оборотах в минуту и инкубируйте в течение 15 минут в темноте. Разбавьте проникающую смесь, добавив один миллилитр PBS, осторожно пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы перемешать и раскрутить неподвижные элементы в предварительно охлажденной центрифуге с температурой четыре градуса Цельсия в течение трех минут.

Полностью отасуньте натант SUP перед инкубацией. Подготовьте первичный рабочий запас антитела, разбавив антитело в буфере PBS плюс 0,5% от 20. Он дополнительно обогащен либо 1% BSA 10% сывороткой осла, либо 10% сывороткой козы.

Затем ресуспендируют мембрану проницаемой клеточной гранулы со 100 микролитрами первичного антитела рабочего запаса. Поместите пробирку на орбитальный шейкер комнатной температуры при 200 об/мин и выдерживайте в течение 30 минут в темноте. Разбавьте первичную смесь антител, добавив один миллилитр проточного буфера.

Осторожно пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы перемешать и вращать клетки в предварительно охлажденной центрифуге при температуре 4 градуса Цельсия в течение четырех минут. Полностью аспирируйте супинат, чтобы удалить несвязанные антитела. Далее повторно суспендируйте гранулу со 100 микролитрами рабочего запаса вторичного антитела.

Повторите инкубацию при защищенной от света комнатной температуре в течение 30 минут. В том же шейкере разведите вторичную смесь антител, добавив один миллилитр проточного буфера. Повторите то же самое перемешивание инверсии пробирки, отжим вниз и удаление надосадочной жидкости, чтобы удалить все несвязанные антитела.

Повторите те же этапы центрифугирования и удаления надосадочной жидкости объемом в один миллилитр еще два раза, но уже со свежим PBS в качестве буфера для стирки. Вместо этого конечным результатом будет получена чистая клеточная гранула, меченная либо внеклеточными или внутриклеточными флуоресцентными антителами CFSC, либо любыми комбинациями трех ресуспендов, меченых клеточных гранул в 150 микролитре проточного буфера. Перенесите клеточную суспензию в проточный цитометр и начните анализ с соответствующими настройками лазерного возбуждающего и эмиссионного фильтра для каждого этажа из четырех.

Используя данные прямого и бокового рассеяния в качестве ориентира, мы устанавливаем начальное прямое и боковое рассеяние в программном обеспечении для анализа проточной цитометрии, чтобы исключить неспецифические точки данных, такие как клеточный мусор и мертвые клетки. Затем, используя необработанные данные из неокрашенной клеточной суспензии в качестве отрицательного контроля, настройте несколько флуоресцентных интегрированных вентилей, которые выбирают положительные сигналы излучения как от внеклеточных, так и от внутриклеточных антигенных меток для учета фоновой флуоресценции от многоцветных. Эффекты спектрального перекрытия перестраивают флуоресцентные вентили с использованием исходных данных контрольной группы, окрашенной одним антителом.

В эксперименте с мультиплексированным факсом карбоксифлуоресцеиновые метки могут быть использованы в качестве базового сигнала, который может различать клетки из двух разных линий или экспериментальных условий без использования антител. Например, в гетерогенной клеточной суспензии можно сразу же дифференцировать нервные клетки, помеченные CFSC, и немеченные фибробласты, просто взглянув на наличие или отсутствие флуоресценции в зеленом канале. Кроме того, в сочетании с мечением CFSE Esther можно использовать флуоресцентные антитела разных цветов для определения дифференциальной экспрессии поверхностных антигенов между мечеными и немечеными субпопуляциями CFSE в смешанной выборке.

Например, клетки SHSY с пятью Y-нейробластомой, меченные CFSE в зеленом флуоресцентном канале, совместно экспрессировали высокие уровни поверхностного антигена CD 24, но не маркера фибробластов CD 54. Напротив, CFSC-отрицательные BJ-фибробласты положительны на CD 54 с более низкими уровнями CD 24. Анализ поверхностных антигенов нейронов также может быть выполнен в сочетании с обнаружением внутриклеточных антигенов на основе антител.

Включение неокрашенных образцов и одиночных окрашенных контрольных образцов для поверхностных антигенов и внутриклеточных антигенов имеет решающее значение в качестве альтернативы мечению внутриклеточных антигенов на основе первичных и вторичных антител, таких как показанная здесь карта нейронных маркеров. Нековалентное флуоресцентное мечение первичного антитела может дать сопоставимые результаты в анализе коэкспрессии и сокращает протокол. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить нервные клетки к базовому проточному цитометрическому анализу с использованием различных альтернативных подходов к мечению и их комбинаций.