Высокая пропускная способность Характеристика взрослых стволовых клеток разработан для доставки терапевтических факторов для Нейропротекторное стратегий
4 января 2015 г.
Это исследование описывает экспериментальную платформу для быстрого определения характеристик сконструированных стволовых клеток и их поведения перед их применением в долгосрочных исследованиях трансплантации in vivo для спасения и восстановления нервной системы.
Общая цель этой процедуры заключается в быстрой охарактеризовании генетически модифицированных стволовых клеток с использованием скрининга с высоким содержанием или системы HCS. Это достигается путем планирования и подготовки экспериментов на 96-луночной пластине, а затем нанесения покрытия различных популяций сконструированных стволовых клеток. Затем подготавливается система скрининга с высоким содержанием жидкости для визуализации живых клеток, а затем инициируется покадровая съемка в течение желаемого периода времени.
Затем, после завершения покадровой визуализации, культуральный планшет подготавливают к процедурам окрашивания клеток, таким как йодид пропидиума, окрашивание на предмет гибели клеток или иммуномаркировка KI 67, чтобы охарактеризовать пролиферацию клеток. Наконец, 96-луночный планшет повторно загружается в систему скрининга с высоким содержанием для флуоресцентной визуализации и получения изображений. В конечном счете, программное обеспечение для анализа изображений используется для проведения анализа данных для определения различных параметров роста клеток.
Эта методология может помочь в решении ключевых вопросов в области биологии стволовых клеток, таких как идентификация и характеристика факторов, стимулирующих дифференцировку стволовых клеток. Применение этого метода распространяется и на клеточные терапевтические стратегии из-за важности характеристики типов клеток до их использования in vivo. Этот метод может дать представление о поведении клеток и может быть применен практически к любому другому типу клеток, которые хорошо растут в культуре.
Кроме того, эти подходы потенциально могут быть использованы на целых организмах, таких как личинки рыбок данио. Для начала создайте карту, как показано здесь, 96-луночного планшета, с описанием различных субстратов и типов клеток, подлежащих исследованию в стерильном культуральном колпаке. Подготовьте рабочую станцию с различными субстратами и планшетом на 96 лунок.
Добавьте в каждый по 100 микролитров раствора субстрата, ну согласно карте. Затем с помощью полоски перфила запечатать крышку и хранить при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи после выделения мезенхимальных стволовых клеток мыши и заражения их лентивирусными векторами согласно текстовому протоколу, удалить субстратные растворы из 96-луночной пластины и использовать около 200 микролитров стерильного PBS для двукратной промывки лунок. После окончательной промывки удалите 200 микролитров среды для клеточной культуры и уравновесьте планшет в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Тем временем, в стерильных условиях, соберите МСК, сначала собрав питательную среду, теперь называемую кондиционированной средой, из колбы в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем добавьте в колбу восемь миллилитров стерильного PBS и аккуратно взболтайте перед аспирацией буфера Чтобы отделить клетки от колбы, добавьте один миллилитр 0,05% трипсина и 0,01% раствора ЭДТА. Когда клетки отделятся, добавьте восемь миллилитров кондиционированной среды перед сбором клеточной суспензии и повторным покрытием клеток в количестве около 300 клеток на лунку.
Согласно текстовому протоколу, инкубируйте планшет в течение двух часов, чтобы позволить МСК прикрепиться к субстрату во время инкубации клеток. Запустите систему HCS и подождите два часа, пока она уравновесится. Установите контроллер окружающей среды на 37 градусов Цельсия и осторожно включите баллон со смесью, содержащей 5% углекислого газа в воздухе, в систему HCS, климатическую камеру, которая подает постоянный источник воздуха.
Затем, после двухчасового периода инкубации, извлеките 96-луночную пластину из инкубатора и поместите ее непосредственно в камеру окружающей среды системы HCS. Дав пластине уравновеситься в течение 30 минут, запустите программное обеспечение для настройки параметров пластины. После того, как параметры визуализации будут настроены, в соответствии с текстовым протоколом, используйте лазерную автофокусировку, чтобы сфокусироваться на дне скважины и получить тестовые изображения с нескольких участков и нескольких скважин, чтобы найти оптимизированную фокальную плоскость.
После того, как фокус будет установлен, начните делать снимки каждые пять минут в течение 48 часов для всех 60 скважин. В конце эксперимента извлеките 96-луночный планшет из системы HCS в стерильных условиях, соберите образцы кондиционированной среды из каждой лунки и перенесите их в свежий 96-луночный планшет. Эти образцы в дальнейшем могут быть использованы для проведения анализа пролиферации клеток KI 67.
Используйте 0,1 молярного фосфатного буфера для промывания клеточных культур в течение одной минуты. После повторения промывки используйте 4% параформальдегид или PFA при комнатной температуре в течение 20 минут для фиксации культур после фиксации. Удалите PFA и с помощью PBS промойте лунки три раза по семь минут каждая.
После блокировки клеток согласно текстовому протоколу нанесите на каждую по 100 микролитров раствора первичного антитела. Хорошо накройте тарелку крышкой и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. После промыть клетки трижды по семь минут.
Для каждого мытья наносите вторичное антитело. Поместите клетки в темноту и выдерживайте при комнатной температуре в течение 90 минут после еще трех мытьев. Накройте пластину крышкой и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия до момента визуализации.
Чтобы выполнить автоматическую визуализацию, загрузите иммуномеченую пластину в систему HCS и дайте пластине уравновеситься в течение 20 минут. Откройте программное обеспечение для сбора и анализа изображений системы HCS. Выберите настройки съемки для объектива с 10-кратным увеличением, используя угол наклона камеры в одну точку и настройку усиления в два раза.
Используйте функцию автоматической экспозиции, чтобы найти плоскость Z, в которой находятся клетки, и рассчитать смещение для каждой интересующей длины волны для продемонстрированного здесь анализа. Захват изображений для DAP, EGFP и S3. Выберите максимальный уровень интенсивности, при котором отрицательные контрольные лунки не показывают сигнал для получения изображения. Используйте те же пороговые настройки для положительных скважин.
Наконец, сделайте снимки и сохраните их в базе данных перед выполнением анализа изображений. В соответствии с текстовым протоколом, как показано здесь, пять различных популяций подтипов МСК были помещены в 96 планшетов для культуры тканей Well с предварительно закодированными различными субстратами на этом рисунке, анти KI 67, который идентифицирует пролиферирующие клетки, и DAPI был использован для оценки того, влияют ли различные субстраты на пролиферацию различных популяций сконструированных МСК, как показано здесь. несмотря на различия в процентном соотношении пролиферирующих МСК, все субстраты поддерживали значительную пролиферацию клеток для каждого подтипа МСК. Этот график показывает, что процент клеток с окрашиванием йодидом пропидия или PI, который идентифицирует мертвые клетки в популяции, низок на всех исследованных субстратах.
Миграция клеток в течение 29-часового периода была проанализирована с помощью покадровой цифровой микроскопии. Пути миграции для первой и второй ячеек отмечены зеленой и синей линией соответственно. Как показано здесь, все подтипы МСК показали самую быструю скорость миграции на внеклеточном матриксе, покрытых поверхностях и самую медленную на непокрытых полистирольных поверхностях.
При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о тщательном планировании и разработке эксперимента для формата многолуночных планшетов, например, планшета с 96 лунками. Другие методы, такие как Eliza S, могут быть выполнены на кондиционных средах, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся производства и секреции терапевтических факторов сконструированными стволовыми клетками после их развития. Процедуры скрининга с высоким содержанием отходов проложили путь исследователям в области биологии стволовых клеток и разработки лекарств для изучения сложных биологических систем с высокой пропускной способностью.
Обзор
В данном исследовании описывается экспериментальная платформа для быстрой характеристики модифицированных стволовых клеток и их поведения перед применением в долгосрочных исследованиях трансплантации in vivo для восстановления и регенерации нервной системы. Эта методология может помочь в решении ключевых вопросов биологии стволовых клеток, таких как идентификация факторов, стимулирующих дифференцировку стволовых клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Высокопроизводительный скрининг
- Пролиферация клеток
Теоретическая часть
- Инженерные стволовые клетки имеют решающее значение для терапевтического применения.
- Характеристика стволовых клеток необходима перед их использованием in vivo.
- Высокопроизводительный скрининг позволяет проводить детальный анализ поведения клеток.
- Данное исследование сосредоточено на мезенхимальных стволовых клетках мыши.
Цель исследования
- Для быстрой характеристики генетически модифицированных стволовых клеток.
- Для использования высокопроизводительного скрининга при визуализации живых клеток.
- Для анализа параметров роста клеток и скорости пролиферации.
Используемые методы
- Подготовка 96-луночного планшета для различных популяций модифицированных стволовых клеток.
- Визуализация живых клеток с использованием системы высокопроизводительного скрининга.
- Процедуры окрашивания клеток для оценки гибели и пролиферации клеток.
- Анализ изображений для определения параметров роста.
Основные результаты
- Успешная визуализация и анализ поведения стволовых клеток в динамике.
- Идентификация факторов, влияющих на дифференцировку стволовых клеток.
- Представления о поведении клеток, применимые к различным типам клеток.
- Потенциальные возможности применения в терапевтических стратегиях с использованием стволовых клеток.
Выводы
- Данная методика представляет собой надежную платформу для характеристики стволовых клеток.
- Полученные данные могут быть использованы в будущих исследованиях in vivo.
- Этот подход может быть адаптирован для других типов клеток и организмов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Быстрая характеристика модифицированных стволовых клеток имеет решающее значение для снижения рисков нейропротекторных терапевтических стратегий перед их применением in vivo. Высокопроизводительный скрининг позволяет проводить количественную оценку пролиферации, миграции и субстрат-зависимого поведения различных линий модифицированных клеток. Такой подход способствует валидации мишеней и повышению прогностической достоверности систем доставки на основе стволовых клеток для моделей нейродегенеративных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы путем сравнения пролиферации и миграции МСК, модифицированных для экспрессии BDNF и GDNF, на определенных субстратах.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизированные высококонтентные показатели для функциональной валидации систем доставки нейротрофических факторов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели пролиферации и жизнеспособности с помощью окрашивания Ki67 и пропидием иодидом для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: способствует разработке воспроизводимых и масштабируемых методов анализа для скрининга поведения стволовых клеток в контролируемых условиях микроокружения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Устанавливает зависимое от субстрата поведение, имеющее значение для заболевания, что позволяет согласовать трансляционные биомаркеры для восстановления нервной системы.
- Практическая ценность: Облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем подтверждения сохранения функции стволовых клеток после генетической модификации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод интегрирован в процесс разработки — от ранней инженерии стволовых клеток до доклинической валидации, что позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейших исследований на основе данных до проведения дорогостоящих исследований in vivo.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о поведении модифицированных MSC на поверхностях с нанесенным внеклеточным матриксом по сравнению с поверхностями без покрытия.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного посева в 96-луночные планшеты, таймлапс-визуализации и определения пролиферации с помощью флуоресцентного анализа.
- Аналитика: Позволяет проводить количественное сравнение параметров роста и путей миграции для различных подтипов клеток и условий культивирования.
- Трансляционные исследования: Связывает характеристику in vitro с доклиническими исследованиями путем подтверждения нейропротекторного поведения клеток перед трансплантацией.
- Повторное использование: Создает универсальную платформу для характеристики любого типа лентивирусно-модифицированных стволовых клеток в высокопроизводительном формате.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неоднозначность поведения стволовых клеток за счет изоляции таких переменных, как тип субстрата и генетическая модификация.
- Практическая ценность: Повышает стандартизацию и воспроизводимость благодаря автоматизированной визуализации и определенным протоколам окрашивания.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления нефункциональных модифицированных линий в процессе разработки.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию линий стволовых клеток с учетом рисков на основе профилей миграции и пролиферации на нейрорелевантных субстратах.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с культурами стволовых клеток, лентивирусной трансдукцией и оборудованием для высокопроизводительного скрининга.
- Результат зависит от систем контроля окружающей среды для визуализации живых клеток и возможностей флуоресцентной микроскопии.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов окрашивания и конвейеров анализа изображений для обеспечения согласованности интерпретации данных.
- При адаптации следует учитывать выбор субстрата и эффективность трансфекции для различных источников или видов MSC.
- Практические ограничения включают длительность анализа (более 48 часов) и необходимость поддержания оптимальной фокальной плоскости при таймлапс-визуализации.
