Минимально инвазивная техника для инъекций в Крыса зрительного нерва

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить минимально инвазивный подход к введению наркотиков или стволовых клеток в зрительный нерв живой крысы. Это достигается путем предварительного обезболивания крысы, размещения ее на подставке для вскрытия и введения шва в конъюнктиву для манипуляций с глазом. Позже, вторым шагом является рассечение орбитального гребня за глазом, чтобы обнажить зрительный нерв.

Далее стеклянная пипетка вводится в зрительный нерв, и препарат или стволовые клетки вводятся до закрытия хирургического поля и оживления крысы от наркоза. В конечном счете, по прошествии определенного периода времени крысу приносят в жертву, зрительный нерв рассекают, и последствия хирургической инъекции или трансплантации могут быть визуализированы с помощью микроскопии. Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что такой подход является минимально инвазивным, что позволяет крысе выживать столько, сколько нужно.

Изучите последствия хирургической инъекции или трансплантации. Демонстрировать процедуру будет Кейт Шварц, студентка-техник из моей лаборатории. Выполняйте все хирургические процедуры под анестезией от двух до 3% изофтора.

Подтвердите соответствующий уровень анестезии путем защемления пальцев ног и частоты дыхания. Убедитесь, что крыса не вздрагивает в ответ на палец ноги. Щипать. При необходимости закрепите животное, чтобы избежать движения головы во время процедуры.

Затем капните каплю лидокаина на хирургический глаз. Используйте искусственные слезы каждые 10 минут, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Сделайте предоперационную инъекцию бупренорфина в дозе 0,01 мг на килограмм подкожно, а затем каждые шесть-восемь часов по мере необходимости.

Держите животное в тепле с помощью грелки. Смочите шерсть кожи головы спиртом. Следите за тем, чтобы не попадать на глаза.

Обязательно используйте стерильные инструменты и стерильную технику, чтобы свести к минимуму риск послеоперационных инфекций. Затем наложите четыре шва на латеральную конъюнктиву и завяжите его достаточным количеством швов, чтобы обеспечить мягкое вытяжение. Сделайте примерно один дюйм разреза на коже, расположенной над орбитальным гребнем.

С помощью скальпеля 10 размера. Втяните кожу и подлежащую фасцию и аккуратно рассеките фасцию. Наложите один шов на втянутую кожу, чтобы обеспечить доступ к верхнему орбитальному мешку и предотвратить чрезмерное кровотечение в месте операции.

Избегайте разрезания кровеносных сосудов во время рассечения фасции. При мягком вытягивании конъюнктивы, вытягивая глаз вниз и из глазницы, в поле зрения окажется верхняя орбитальная мышца. Для того, чтобы обнажить зрительный нерв, необходимо удалить ретроорбитальный жир, а эту мышцу разрезать.

Жир можно выбросить, и его не следует заменять после инъекции. С этого момента фасция зрительного нерва должна быть видна как пучок самого зрительного нерва вместе с кровеносными сосудами, обернутыми твердой мозговой оболочкой. Чтобы сделать более глубокое рассечение, сделайте небольшой разрез в ДРА с помощью скальпеля или скошенной иглы 31 калибра, чтобы сделать пирсинг менее травматичным, подготовьте микропипетку из вытянутого стекла диаметром от 50 до 100 микрон для обеспечения стабильности.

Установите микропипетку на микроманипулятор и присоедините к пластиковому шприцу объемом 20 куб. см. Вытяните гранулы или стволовые клетки, восстановленные в количестве от 0,5 до 1 микролитра, в микропипетку ретроградно вместе с 0,5 микролитрами раствора метилового синего до и после того, как стеклянная пипетка будет загружена красителем. С помощью шприца объемом в один куб. см и иглы 30 калибра опустите кончик микропипетки на зрительный нерв чуть выше надрезанной твердой мозговой оболочки.

Небольшое, но быстрое движение стеклянного наконечника в зрительный нерв приводит к наименьшему повреждению при медленном и постоянном давлении на поршень. Синий краситель Эванса должен выделять область инъецируемого зрительного нерва. Краситель должен оставаться локализованным в пределах зрительного нерва, не просачиваясь в субарахноидальное пространство.

Следуйте за второй полосой синего красителя Evan's, чтобы определить, когда инъекция стволовых клеток завершена. Когда в зрительный нерв будет введен необходимый объем, отпустите поршень. Держите микропипетку неподвижно внутри зрительного нерва в течение пяти минут, чтобы предотвратить выброс высокого давления при извлечении микропипетки после завершения инъекции.

Извлеките микропипетку вместе с ватными наконечниками, используемыми для обеспечения гемостаза. Сшить кожу шелком 3.0 и снять конъюнктивальный шов. Держите крыс в тепле на грелке, пока они не выйдут из наркоза.

Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего состояния грудины. Если животное проявляет признаки боли, включая чрезмерную вялость, атаксию или затрудненное дыхание, проводите соответствующую анальгезию внутримышечным бупренорфином до трех раз в день. После эксперимента крыс приносили в жертву и обливали паральдегидом.

Зрительные нервы были тщательно рассечены и установлены для рассечения криостата, показанный здесь, является примером зрительного нерва крысиной норы с меньшей мощностью, в который был введен синий краситель Эвана. Чтобы визуализировать участок, стрелка указывает точное место инъекции. Это расслоение было сделано в течение нескольких дней после инъекции, на что указывает ограниченная диффузия красителя вниз по нерву после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области регенеративной неврологии к изучению новых способов регенерации зрительного нерва и потенциального восстановления утраченного зрения в этой модели демиелинизирующего заболевания у крыс.