Оценка стволовых клеток Недвижимость в человека рака яичников клеток с использованием много- и отдельных клеток на основе сферах Анализы

Общая цель этой процедуры заключается в оценке свойств стволовых клеток карциномы яичников человека с использованием много- и одноклеточных анализов сфер. Это достигается путем выбора двух репортерных RFP лентивирусных трансдуцированных клеток SOX с помощью обработки Pur Mycin на втором этапе, положительные и отрицательные RFP клетки выделяются и покрываются фактами как одно- или многоклеточные колонии на лунку. Затем образование первичной сферы анализируется под микроскопом, а затем культуры первичной сферы диссоциируются и повторно покрываются для анализа образования вторичной сферы.

В конечном счете, эти анализы сфер используются для расчета доли предполагаемых стволовых клеток рака яичников, которые проявляют способность к образованию сфер. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области раковых стволовых клеток, например, каковы некоторые потенциальные популяции раковых стволовых клеток и какова частота во всей опухолевой сумке. Хотя этот метод может дать представление об идентификации стволовых клеток рака яичников, он также может быть применен для выделения раковых стволовых клеток из других солидных опухолевых образований, таких как карцинома молочной железы.

Через 24 часа после индуцирования клеток карциномы яичников человека лентивирусными частицами удалить вирусную надосадочную жидкость и промыть клетки в культуре PBS. Клетки в полной среде в течение 48 часов. Затем смените среду и добавьте 10 микрограмм на миллилитр пиромицина через пять дней.

Обработайте культуры щитом по одной в разведении от одного до 1000 на следующий день. Промойте клетки в PBS, а затем отсоедините их с 0,05% трипсином ЭДТА. Через три минуты прекратите реакцию полной средой.

Подсчитайте ячейки и центрифугируйте их в течение пяти минут при 300-кратном перегрузке и комнатной температуре. Осторожно ресуспендируйте клетки в 0,5-1 миллилитрах стерильного PBS, а затем процедите полученную клеточную суспензию через фильтр 40 микрометров. Отрегулируйте ячейки в соотношении от пяти до 10-6 клеток на миллилитр, а затем добавьте 100 микролитров сферической среды в каждую лунку сверхнизкой присадки 96-луночной пластины для следующего анализа сфер на основе одной клетки.

Используйте режим одной ячейки, чтобы отсортировать по одной ячейке в каждую лунку пластины. Затем проводится микроскопическая оценка клеток для оценки эффективности покрытия. Инкубируйте клетки в свежих сферах при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 с ежедневным приемом основного фактора роста фибробластов и эпидермального фактора роста.

Через неделю определите количество возникающих опухолевых сфер с помощью световой микроскопии и наличие флуоресцентного сигнала от интегрированной репортерной системы с помощью флуоресцентной микроскопии. Сферы, диаметр которых превышает 100 микрометров, считаются большими сферами, а сферы диаметром от 50 до 100 микрометров — маленькими сферами. Мы заботимся о том, чтобы считать реальные сферы, а не кластеры клеток.

Затем рассчитайте долю сферообразующих RFP-положительных или RFP-отрицательных ячеек по формуле до пассажа. Сферы начинаются с переноса содержимого каждой лунки в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Затем промойте каждую лунку от трех до пяти раз с помощью PBS, чтобы убедиться, что вы собрали все сферы, и вращайте ячейки в течение 10 минут при температуре 300 G и комнатной температуре.

После центрифугирования удалить снат и суспензировать гранулы в 200 микролитрах 0,05%трипсин ЭДТА при 37 градусах Цельсия в мягком шейкере в течение пяти минут. Если через пять минут не видно больших сфер, осторожно тритируйте клеточный раствор с помощью наконечника пипетки объемом 100 микролитров и добавьте 500 микролитров готовой среды для инактивации трипсина. Понижающие клетки осторожно ресуспендируют гранулы в сферах, среду и сливают полученную клеточную суспензию через фильтр 40 микрометров, как только что было рассчитано.

Наконец, для последовательного повторного покрытия одиночных ячеек, затравите одиночные клетки из одной первичной сферы в 100 микролитров сфер, среду на лунку в новую сверхнизкую 96-луночную пластину. Затем используйте ту же формулу, что и для анализа первичных сфер, чтобы оценить долю сферообразующих клеток во вторичных сферах. Анализы в многоклеточных анализах почти 40% RFP-положительных клеток карциномы яичников человека по сравнению с 20% RFP-отрицательных клеток дали начало отдельной опухолевой сфере в анализе первичных сфер

Удивительно, но большее количество сфер подсчитывается из меньшего числа покрытых ячеек как в средах на основе MGEM, так и в средах на основе D-M-E-M-F 12, что свидетельствует о том, что методы осаждения сильно искажают результаты в этом анализе. Напротив, когда клетки иммобилизуются добавлением 1%-ной метилцеллюлозы, эффективность образования сфер в основном не зависит от плотности клеток в культурах на основе многоклеточных сфер. Примерно 35% клеток из RFP-положительных сфер теряют свой красный флуоресцентный сигнал после семи дней культивирования, что позволяет предположить, что эти клетки подверглись дифференцировке, в то время как более 65% клеток сохраняют RFP-сигнал, предполагающий способность к самообновлению.

Напротив, клетки из сфер, полученных из первоначально отрицательных RFP-отрицательных клеток, остаются RFP-отрицательными, что указывает на то, что они не могут восстановить потенциал стволовых клеток в этих условиях. Флуоресцентная микроскопия, выполненная на шарах, полученных из одиночных клеток, подтверждает эти данные, демонстрируя, что отдельные сферы, полученные из RFP-положительных клеток, содержат как RFP-положительные, так и RFP-отрицательные клетки. В то время как сферы, полученные из негативных клеток RFP, сохраняют отсутствие красного сигнала после этой процедуры.

Другие меры, такие как антитела, окрашивание или анализ экспрессии генов с помощью количественной ПЦР, могут быть выполнены для дальнейшей характеристики клеток с высокой образовательной способностью. При проведении этой процедуры важно помнить, что анализы трансплантации in vivo у мышей с ослабленным иммунитетом должны быть выполнены для подтверждения свойств опухолевых стволовых клеток клеток, инициирующих сферу.