Культура эмбриональных мыши Cochlear эксплантов и Перенос генов путем электропорации

Целью данной процедуры является культивирование и электрохирургическое воздействие на эмбриональную улитку мыши. Для изучения различных аспектов развития улитки, включая морфогенез, дифференцировку и события роста, для этого сначала получают голову из эмбрионального эмбриона мыши на 13-й день. Затем обнажите внутренние уши, удалив мозг, и изолируйте их от развивающейся височной кости, отделив от основания черепа.

Затем удалите вышележащий хрящ и откройте улитковый проток для получения сенсорного эпителия улитки. Заключительным этапом является культивирование рассеченной улитки с электропорацией или без нее в течение одной недели. В конечном счете, имплантаты могут быть проанализированы для визуализации живых клеток или фиксированного иммуноокрашивания, а также проанализированы с помощью конфокальной визуализации, культивирования эмбриона мыши.

Кохлеарный эксплан представляет собой прекрасную систему для изучения различных аспектов органогенеза, таких как пролиферация, сульфатная спецификация и полярность в развивающейся улитке, а также то, как эти события способствуют росту и дифференцировке. Таким образом, эта методика позволяет проводить фармакологические манипуляции и контролировать функции генов ex vivo. Таким образом, этот метод в сочетании с переносом генов с помощью электропорации позволяет изменять экспрессию интересующего гена и контролировать его функцию на уровне одной клетки.

Чтобы начать эту процедуру, поместите голову эмбриона мыши Е 13 в стерильную чашку согара, содержащую холодный раствор для препарирования. Под препарирующим микроскопом обездвижите головку эмбриона, поместив мельчайшие булавки вокруг области глаза. Затем с помощью двух пар стерильных щипцов аккуратно снимите кожу и вскройте череп с тыльной стороны по средней линии.

После этого следует удалить головной мозг из полости черепа. Внутреннее ухо, расположенное в височных костях, можно определить по слизистой оболочке кровеносного сосуда вокруг них. Затем отделите внутреннее ухо от височных костей, поместив щипцы под ткань и изолировав внутреннее ухо от основания черепа.

После этого перенесите рассеченное внутреннее ухо в новую посуду с холодным раствором для препарирования. Теперь сориентируйте внутреннее ухо так, чтобы вентральная сторона была обращена вверх. Стабилизируйте внутреннее ухо, аккуратно вставив острый конец булавок минухина через вестибулярную часть.

С помощью щипцов ультратонкой очистки разрежьте вышележащий хрящ, сделав разрез возле овального окна. Следите за тем, чтобы щипцы не вводились слишком глубоко в хрящ, так как вышележащий хрящ иногда срастается с кохлеарным протоком. Затем аккуратно удалите хрящ из улитки.

Затем обнажите сенсорный эпителий, поместив щипцы у основания или на вершине улиткового протока, и аккуратно вытяните крышу улитки. В качестве последнего шага осторожно удалите подлежащую соединительную ткань из обнаженного сенсорного эпителия так, чтобы основание кохлеарного эксплана было плоским. После этого изолируйте рассеченную улитку от вестибулярного отдела внутреннего уха.

Перенесите рассеченный сенсорный эпителий улитки в колодец с базальной мембраной матрицы Покрытая культура с помощью 1,5-миллиметровой стерильной лопатки, если требуется дальнейшая очистка для удаления лишней ткани, это можно выполнить на данном этапе. Затем ориентируйте кохлеарный эксплан просветной поверхностью эпителия вверх. Отсадите из базальной мембраны матрицу раствор DMEM, тщательно разровняйте ткань и аккуратно добавьте в посуду 150 микролитров свежей питательной среды.

Следите за тем, чтобы каждый x explan a хорошо прилегал к стекло с покрытием и не плавал в питательной среде. Затем аккуратно перенесите микрорассеченную улитку в стерильную 150-миллиметровую чашку для культивирования и поместите ее в инкубатор для тканевых культур. 37 градусов по Цельсию с 5% углекислого газа в течение трех-шести ДЕЛ.

После 1D IV. Рассмотрите культуру под препарирующим микроскопом, чтобы убедиться, что кохлеарный эксплан хорошо прилегает к чашке для культивирования. Затем продолжайте инкубацию культуры in vivo в течение желаемого периода времени, прежде чем обрабатывать ее для иммуногистохимии, чтобы настроить на электропорацию. Сначала простерилизуйте одну стеклянную тарелку диаметром 100 миллиметров, покрытую сигарой, путем автоклавирования или замачивания в 70% этаноле в течение примерно 20 минут.

Перед использованием дайте ему высохнуть на воздухе на чистом скамейке. Теперь подготовьте ДНК из выбранного вектора экспрессии с помощью подходящего набора для подготовки maxi или MIDI. Векторы экспрессии, используемые в этом протоколе, представляют собой конструкт экспрессии H one и конструкт нейро D с одной экспрессией.

И конечная концентрация ДНК должна составлять не менее одного микрограмма на микролитр в стерильной свободной воде ДНК РНК для электрообработки ДНК в энерическом кохлеарном объяснении. Добавьте 10 микролитров раствора плазменной ДНК в свежую 100-миллиметровую посуду, покрытую сигарой. Затем перенесите полностью рассеченный эксплан улитки в раствор ДНК просветной поверхностью эпителия вверх.

Слегка наклоните улитку так, чтобы она была перпендикулярна плоскости блюда. Затем поместите лопасть отрицательного электрода по направлению к сенсорному эпителию, а лопатку с положительным электродом рядом с основанием улитки с помощью электроатора. Подача от 9 до 10 импульсов длительностью 24 милливольта 30 миллисекунд.

Затем добавьте 100 микролитров теплой питательной среды в улитку с электрическим рейтингом. Повторите процедуры для всех экспланов улитки и для ДНК всех генов, представляющих интерес, прежде чем перенести электростабилизированную улитку в чашку с покрытием матрицы базальной мембраны для осаждения. Затем культивируйте всю электрозаряженную улитку в увлажнённом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия 5% углекислого газа в течение желаемого периода времени, который затем будет обработан для иммуноцитохимии.

На этих изображениях показаны эмбриональные кохлеарные имплантаты 13-го дня из мышиных пабов дикого типа CD one, которые электропорируются с помощью конструкций TH one, EEG FP или neuro D one EGFP Reporter. Они были помечены иммуноспецифическим маркером волосковых клеток, анти-мио семь А или нейрональным маркером два к одному красным цветом. Электрозаряженные клетки, которые могут быть визуализированы с помощью экспрессии EGFP, видны по всему большому эпителиальному гребню, малому эпителиальному гребню и клеткам сенсорного эпителия.

Нейро D один трансфицировал эпителиальные клетки улитки после пяти DIV приобрел нейрональный фенотип с дендритными отростками, большинство из которых были положительными для двух one или T oh H one. Трансфицированные клетки оказались положительными на myo seven. Выражение После освоения этой техники можно сделать за три-четыре часа за литр интеллекта от восьми до 10 глотков.

Это даст достаточно времени для вскрытия культуры, электропорации и гальванизации эксплана.