Интубация опосредованного Интратрахеального (IMIT) Инстилляции: неинвазивный, легких конкретных Система доставки

Общая цель этой процедуры заключается в неинвазивной доставке бактерий непосредственно в легкие мышей. Это достигается путем предварительной загрузки в газонепроницаемый шприц воздушной подушки объемом 150 микролитров, а затем 50 микролитров приготовленной бактериальной суспензии. На втором этапе мышь под наркозом интубируется с помощью катетера 20 калибра с использованием направляющей проволоки для облегчения установки.

Затем, после подтверждения успешности интубации с помощью простого расходомера, бактериальный инокулят доставляется через катетер непосредственно в легкое с помощью тупой иглы длиной 22 калибра. В конечном счете, интратрахеальная инокуляция с опосредованием интубации или без инокуляции может быть использована для изучения заболеваний нижних дыхательных путей у мышей, избегая одновременного поражения верхних дыхательных путей. Основное преимущество имитации перед методами интерназальной инокуляции заключается в том, что эта методика позволяет обеспечить точную и воспроизводимую доставку инокулята непосредственно в легкие.

Поскольку ЭИТ является нехирургическим методом, он также снижает вероятность осложнений, связанных с хирургическими внутритрахеальными процедурами. Хотя этот метод может обеспечить надежный механизм доставки бактерий в легкие для изучения патогенеза, IMA также может быть применен для доставки других реагентов, таких как соединения окружающей среды для изучения повреждения легких, целевая доставка терапевтических средств для лечения и доставка визуализирующих зондов или РНК для изучения фундаментальной биологии легких. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности на этапе интубации, так как этот этап требует тщательного позиционирования животного и автоматического эндоскопа для введения проводника.

Визуальная демонстрация этого метода полезна, так как первоначальное размещение проводника в трахее концептуально трудно описать новым исследователям. За 15 часов до установки инокулируйте три миллилитра культуры бульона одной колонией бактерий и выращивайте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и в вибростенде при 200 оборотах в минуту. Через 15 часов раскрутите один миллилитр клеток в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра и снова суспендируйте нёбо в одном миллилитре PBS.

Затем измерьте разведение бактериальной суспензии от одного до 10 при наружном диаметре 600, чтобы определить концентрацию бактерий. Затем разведите бактериальные клетки в PBS до нужной концентрации бактерий на 50 микролитров посевного материала. Для установки ЭИТ мышей готовят к ИИТ путем введения 2% раствора лидокаина мышам с легким обезболиванием с помощью игольчатых мышей.

Возвращение к анестезии, пока лидокаин начинает действовать. Теперь наберите 150 микролитров воздуха в 250-микролитровый шприц газового типа, оснащенный тупой иглой длиной 22 калибра. Затем переместите тефлоновый поршень с отметки 150 микролитров до отметки 200 микролитров на корпусе шприца, чтобы набрать 50 микролитров бактериального инокулята при загрузке шприца.

LA, мышь с седативными препаратами, лежащая на спине на интубационной платформе, фиксирует животное резцами на кольце без кольца, прикрепленного к полоске Velcro, соединенной с платформой. Поднимите мышь под углом 45 градусов, а затем с помощью микроватного аппликатора втяните язык вращательным движением доминирующей руки. Затем с недоминирующей рукой используйте операционный отоскоп с интубационным зеркалом, чтобы сохранить ретракцию языка и визуализировать надгортанник.

Затем, держа в доминирующей руке направляющую проволоку, продетую через катетер 20 калибра, интубируйте мышь на глубину 10 миллиметров внутри трахеи и извлеките отоскоп. Закрепите катетер недоминантной рукой. Затем кратковременно прикрепите к катетеру приманку, соединенную длиной одной 16-й прозрачной трубки, содержащей цветной краситель.

Краситель должен быстро мигрировать туда и обратно в ответ на дыхание животного после успешной интубации животного. Вставьте тупую иглу 22 калибра в катетер и введите инокулюм непосредственно в легкое одним движением жидкости. Затем немедленно извлеките иглу и катетер из животного и верните мышь в клетку с контролем до полного восстановления животного от наркоза.

Чтобы оценить бактериальную нагрузку инфицированной легочной ткани, удалите легкие с помощью стерильной техники и поместите ткань в стерильный предварительно взвешенный пакет для образцов весом в одну унцию. Взвесив пакет с образцом и легкие, добавьте один миллилитр стерильного PBS в ткань и перепродайте пакет с образцом. Затем аккуратно прокатите серологической пипеткой объемом 25 миллилитров по пакету с образцами, чтобы гомогенизировать ткань.

Удалите соединенные ткани через стерильный полиэфирный фильтр и обработайте гомогенат тритоном X 100 в конечной концентрации 1%, чтобы освободить бактерии. Затем с помощью многоканальной дозатора можно провести шестикратное последовательное разведение гомогената в 96-луночном планшете UBO. Затем с помощью многоканального устройства с восемью лунками нанесите гомогенат в три раза 10 микролитров аликвот на агаровую пластину LBA.

Наконец, инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и перечислите колониеобразующие единицы на следующий день. Доставка бактерий с помощью этого метода очень эффективна: более 98% инокулята Pseudomonas aerogen было извлечено из легких закапываемых животных в этом репрезентативном эксперименте. Кроме того, установка ЭОП обладает высокой воспроизводимостью независимо от концентрации вводимого посевного материала.

Чтобы визуализировать распределение введенного материала с помощью метода ИИТ, 50 микролитров 0,1% красителя Кумаси блестящего синего цвета могут быть доставлены в легкие, как только что было продемонстрировано для посевного материала. Отметим, что распределение красителя по всем долям легкого после освоения. Этот метод может быть быстро выполнен командой из двух исследователей в среднем за две-три минуты, включая анестезию, прививку IMA и восстановление после анестезии.

При попытке выполнить эту процедуру важно не сделать более двух неудачных попыток интубации мыши. Неудачная интубация может привести к потенциальной травме от введения катетера в пищевод, а не в трахею. Многие респираторные патогены, в том числе те, которые требуют сдерживания abs L three, могут быть эффективно доставлены с помощью imed, поскольку эта процедура может быть выполнена, как показано в защитных шкафах, а также исследователями, носящими полную защиту органов дыхания, включая лицевой щиток.

Мы продемонстрировали, что imit является очень точным и эффективным методом доставки материалов непосредственно в легкие мышей. Эти свойства делают imit хорошо подходящим для исследований типа GLP, требующих высоковоспроизводимых модельных систем.