Измерение белка стабильности в жизни у эмбрионов данио рерио с помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP)

Общей целью данного эксперимента является измерение внутриклеточной и внеклеточной стабильности белка в живых эмбрионах рыб данио-рерио. Это достигается путем маркировки интересующего белка фотоконвертируемым флуоресцентным белком и введения мРНК, кодирующей слияние, а также флуоресцентного красителя в эмбрионы рыбок данио. Затем фотоконвертируемый термоядерный белок преобразуется в фото, который импульсно помечает белок.

В этом примере гибридный белок секретируют, а затем следят за распадом интенсивности внутриклеточной и внеклеточной фотопреобразованной флуоресценции с течением времени и надевают экспоненциально уменьшающуюся функцию для определения внутриклеточного и внеклеточного периода полураспада гибридного белка. Результаты показывают стабильность in vivo фотоконвертируемых гибридных белков, основанную на затухании флуоресцентного сигнала с течением времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии и биологии развития.

Например, как стабильность влияет на распределение и доступность белка. Мы используем наше программное обеспечение EP для анализа данных FD DP. EP находится в свободном доступе на нашей веб-странице После генерации ограниченной мРНК в кодировании кодирующего зеленого в красный фотоконвертируемый гибридный белок, представляющий интерес, перенос примерно 31 эмбриона рыбки данио-рерио на стеклянную или покрытую агаровой розой пластиковую чашку Петри диаметром пять сантиметров или покрытую агаровой розой, содержащую около восьми миллилитров эмбриональной среды.

Добавьте в блюдо два миллилитра предварительно приготовленного и размороженного про най бульонного раствора и выдерживайте при комнатной температуре от пяти до 10 минут. Наполните стеклянный динамик средой для эмбрионов и, избегая контакта с воздухом или пластиком, перенесите эмбрионы в стакан, наклонив чашку Петри во время погружения ее в среду. После того как зародыши осядут на дно стакана, высыпьте большую часть среды и с помощью свежей среды аккуратно замените ее.

Легкое закручивание свежей среды приведет к тому, что эмбрионы потеряют свой ослабленный корион. После повторения промывки используйте стеклянную пипетку PEs с обожженным наконечником, чтобы перенести покрытые оболочкой эмбрионы в чашку для инъекций с агарозным покрытием. Затем совместно введите мРНК и конъюгат трехкилодальтонной цепи Alexa 4 88 DExT непосредственно в центр клетки, чтобы обеспечить равномерное распределение мРНК и красителя.

Как только начнется расщепление, перенесите введенные эмбрионы в лунку с агарозным покрытием от 1 до 2% в пластиковой чашке с шестью лунками, заполненной эмбрионами, средой, и инкубируйте в темноте при температуре 28 градусов Цельсия с помощью стереомикроскопа, пока эмбрионы не достигнут поздней стадии сферы, определите от одного до пяти здоровых эмбрионов и используйте стеклянную полиэтиленовую пипетку с обожженным кончиком, чтобы извлечь их из чашки. Осторожно извергните эмбрионы в микроцентрифужную пробирку, содержащую примерно один миллилитр расплавленной 1% низкой температуры плавления в одной среде для эмбрионов данио. Затем втяните эмбрионы обратно в пипетку вместе с небольшим количеством арос.

Затем аккуратно выбросьте арос и эмбрионы на крышку. Стакан со стеклянным дном блюда. Чтобы повторно использовать стеклянную пипетку, очистите остаточные дозаторы, чтобы предотвратить засорение, быстро пипетируя эмбриональную среду вверх и вниз, быстро работая до того, как арос затвердеет.

С помощью металлического зонда расположите эмбрионы так, чтобы полюс животного был обращен к покровному стеклу под стереомикроскопом. Следите за положением эмбрионов и при необходимости корректируйте их, пока агарро не затвердеет. Когда агарро застынет, используйте одну среду для зародышей данио, чтобы наполнить стеклянную форму на дне.

Чтобы подготовиться к преобразованию фотографий, установите в инкубаторе температуру 28 градусов Цельсия и нанесите на объектив большую каплю погружного масла, чтобы масляная пленка между объективом и защитным стеклом не лопнула при перемещении сцены в разные положения эмбриона. Во время съемки надежно поместите тарелку со стеклянным дном на сцену, чтобы тарелка не смещалась при движении сцены. Затем в программном пакете конфокального микроскопа определите положение каждого эмбриона.

Отрегулируйте глубину Z для каждого эмбриона и попытайтесь нацелиться примерно на одну и ту же плоскость в каждом эмбрионе, используя лазеры 4 88 и 5 43 нанометров. Получение изображений перед конверсией фотографий. Затем настройте программное обеспечение конфокального микроскопа для получения изображений в каждом из ранее определенных положений с соответствующими условиями визуализации.

Каждые 10 или 20 минут или 5 часов для фотопреобразования термоядерного белка переключайтесь на объектив с 10-кратным увеличением и подвергайте группы эмбрионов воздействию ультрафиолетового излучения ртутной лампы с фильтром примерно от 300 до 400 нанометров на 100% выходе в течение двух минут. Сместите фокус вдоль оси Z, чтобы обеспечить равномерное преобразование фотографий после преобразования фотографий. Немедленно вернитесь к цели 25 или 40 раз и убедитесь, что ранее определенные позиции все еще точны.

Если блюдо сместилось во время фотоконвертации, переопределите положение эмбрионов. Запустите временной курс визуализации и оставьте его на пять часов. Обратите внимание на время, прошедшее между преобразованием фотографий и началом визуализации для каждого эмбриона.

Время от времени проверяйте ход эксперимента и следите за уровнем среды Даниэль, при необходимости добавляя еще. Начните с визуального изучения наборов данных о временном потоке каждого эмбриона. Отбросьте наборы данных эмбрионов, которые погибли во время визуализации, которые значительно сдвинулись, которые имеют очень низкий уровень фотопреобразованного сигнала или которые содержат участки клеток, которые выглядят необычно и которые перестали двигаться и делиться.

Используя программный пакет на основе Python, PI F DAP создает маску с использованием сигнала Alexa 4 88, который является строго внутриклеточным. Чтобы разделить внутриклеточный и внеклеточный фотопреобразованный сигнал, приложите маску к соответствующему изображению красного канала, чтобы предотвратить учет внутриклеточных пикселей. При вычислении средней внеклеточной интенсивности для измерения средней внутриклеточной интенсивности инвертируйте маску, отображайте сгенерированные замаскированные изображения, визуально осматривайте их и отбрасывайте наборы данных, в которых маски неточно отличают внутриклеточное пространство от внеклеточного.

Используйте PI F DAP для расчета средней интенсивности внеклеточной и внутриклеточной флуоресценции для каждого изображения. Затем подогните данные флуоресценции, как показано здесь, в соответствии с рекомендациями в текстовом протоколе, и рассчитайте внеклеточный и внутриклеточный белок. Период полураспада тау от скорости клиренса.

Косоглазие Констанции К — это секретируемый белок, который индуцирует экспрессию энтодермальных генов во время эмбриогенеза рыбок данио. В этом эксперименте эмбрионам вводили декстран Alexa 4 88 и мРНК, кодирующую косоглазие DENDRA 2, и подвергали анализу F DAP. Как показано на рисунке, интенсивность внеклеточного фотопреобразованного сигнала со временем уменьшается.

С помощью PI F dap были сгенерированы профили внеклеточной интенсивности от 23 эмбрионов, и данные были подобраны с моделью клиренса первого порядка. Результаты показывают, что средний период полураспада тау составляет 116 минут. Схожие профили интенсивности и белка.

Период полувыведения был получен, когда интервалы между визуализациями составляли 10 или 20 минут. Предположение о том, что обесцвечивание фотографий или случайное преобразование фотографий не влияли на значительные изменения интенсивности. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать затухание флуоресценции после преобразования фотографий.

Измерять in vivo. Период полураспада фотоконвертируемых гибридных белков в живых эмбрионах рыбок данио