Простой метод ДНК флуоресценции На месте Гибридизация, чтобы раздавил хромосом

Общая цель этой процедуры заключается в использовании гибридизации ДНК in situ для картирования гетерохроматических последовательностей на митотические хромосомы. Это достигается путем препарирования мозга личинок третьей части звездчатой дрозофилы или другой ткани, представляющей интерес. Второй шаг – фиксация ткани на покровном листе.

Затем ткань сжимается между покровным стеклом и предметным стеклом. Чтобы подготовить хромосомы к гибридизации, заключительным этапом является гибридизация коротких синтезированных олигозондов с раздавленной тканью. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия используется для того, чтобы показать локализацию последовательностей, комплементарных олигозондам на хромосомах.

Главным преимуществом этого метода перед существующими методами является его простота. Большинство других методов гибридизации хромосом и С-2 включают в себя промывки с большим количеством амида, что может быть дорогостоящим и грязным. Наш метод не требует промывки IDE, что делает его более дешевым, чистым и быстрым методом.

Хотя этот метод обеспечивает простой способ визуального отображения последовательностей на соматических хромосомах мозга дрозофилы, он также может быть использован для отображения последовательностей на других типах хромосом из разных тканей различных организмов. Для каждого предметного стекла подготавливайте четыре-пять тканей, но не больше для вскрытия мозга. Начните с выбора блуждающих личинок третьего возраста и сбора их в каплю одного XPBS.

Выбирайте флаконы для сбора, которые не переполнены. Под эндоскопом для вскрытия используйте ультратонкий пинцет, чтобы захватить крючки для рта, и еще одну пару, чтобы захватить две трети по длине тела. Затем осторожно потяните за крючки для рта, чтобы обнажить мозг, вентральные ганглии, слюнные железы и части пищеварительного тракта.

Затем выщипните мозг и вентральные ганглии от других тканей и перенесите их в каплю одного XPBT на пластиковой пластине. Для вскрытия яичек собирают самца трехдневного пуя. Трехдневные пюи имеют желтые тела и красные глаза.

Те, у кого подушечки крыльев меньше, являются самцами. Захватите куколку в верхней части живота возле грудного отдела одним пинцетом и второй парой пинцетов. Возьмитесь за самый дистальный кончик живота, затем вытащите яички в форме капли.

Они окружены жировыми телами, которые можно аккуратно стряхнуть, оторвать любые внешние части тела от яичек, что помешает надлежащему сплющиванию и перенести семенники по капле одного XPBT на чистую тарелку. Как только все ткани будут собраны, обработайте их гипотоническим раствором, чтобы улучшить разделение сестринских хроматид. В ехроматических областях перенесите в ткани каплю 0,5% цитрата натрия на 10 минут.

Для получения такого эффекта не рекомендуется использовать колхицин, поскольку он может вызвать артефакты в морфологии хромосом. Теперь зафиксируйте ткани с помощью ультратонкого пинцета. Переложите их в каплю 20 микролитров свежеприготовленной 2,5% PFA в 45% уксусной кислоте на чистом покрытии, обработанном сигма-покрытием, равномерно распределите салфетки в фиксаторе и инкубируйте их в течение четырех минут при комнатной температуре, а затем приступайте к сдавливанию покровных накладок, слегка положив покрытое полилизином предметное стекло лицевой стороной вниз на ткань и покровное стекло.

Не нажимайте на нижнюю сторону затвора. Лечения. Покровные накладки с сигма-покрытием помогают гарантировать, что кабачковая ткань останется на слайде после снятия покровного слипа. Однако в редких случаях ткань может оставаться прикрепленной к покровному листу.

На этом этапе мы рекомендуем выполнять раздавливание тканей. Теперь переверните слайд и поместите его в сложенный лист плотной бумаги. Затем на устойчивой поверхности с помощью большого пальца очень сильно надавите прямо вниз по покровному листу.

Не нажимайте таким образом, чтобы сдвинуть крышку, иначе она размажет ткань. Очень сильное нажатие обычно приводит к образованию хорошо разрешенных хромосом в ткани кабачка. Однако иногда вы можете столкнуться с изменчивостью качества хромосом, такой как неполные, сжатые или фрагментированные хромосомы.

Итак, опять же, мы рекомендуем выполнить два или три повторных раздавливания тканей. Перенесите сборку в глыбу льда на несколько минут, затем погрузите ее в жидкий азот до тех пор, пока азот не перестанет кипеть или дольше После снятия предметного стекла непосредственно перед тем, как ткань оттает, используйте свежее лезвие бритвы, чтобы поднять уголок защитного стекла. Тем самым удаляя его.

Будьте осторожны, чтобы не поцарапать ткань. Затем быстро поместите предметное стекло в банку с коплином, наполненную 100% этанолом, и оставьте на пять минут. Снимите фитиль с предметного стекла излишки этанола, не касаясь ткани, и дайте предметному стеклу высохнуть на воздухе в течение часа.

Затем предметные стекла могут храниться в камере для высыхания от нескольких недель до нескольких месяцев. Начните с добавления 100 нанограмм каждого зонда к 20 микролитрам 1,1 x гибридизационного буфера для 22 микролитров одного x гибридизационного буфера. Затем нанесите смесь пипеткой на неподвижную ткань, оставив ткань нетронутой, и аккуратно нанесите покровный лист.

Небольшой пузырь воздуха, не соприкасающийся с тканью, не будет представлять проблем, но наличие новых пузырьков требует повторного наложения покровного стекла. Установите предметное стекло на плоскую сторону термоблока с температурой 95 градусов Цельсия и накройте его фольгой. Подождите пять минут, в течение которых вы можете подготовить камеру влажности, добавив влажные бумажные полотенца в коробку для чаевых.

Затем снимите предметное стекло. Осторожно заверните предметное стекло в растянутую форму и перенесите его во увлажненную камеру, состоящую из влажного полотенца В коробке для наконечников выдержите предметное стекло в камере в течение четырех часов до ночи при температуре 30 градусов Цельсия. Эта температура хорошо подходит для зондов с низким содержанием GC, но для зондов с более высоким содержанием GC может потребоваться устранение неполадок с помощью температур гибридизации.

После инкубации осторожно снимите пара-пленку и медленно приподнимите крышку на один угол. Затем промойте предметное стекло три раза в буфере 0,1 XSSC в течение 15 минут за одну стирку. Накрывайте банку фольгой во время мытья, чтобы свести к минимуму воздействие света.

Для длинных биотинилированных зондов добавьте стержень domine avadon и промойте перед тем, как продолжить. Во-первых, высушите участок вокруг ткани и покройте ткань 100 микролитрами блокирующего раствора. Затем аккуратно нанесите новую крышку накидкой, не задерживая пузыри.

Снова обматываем горку парамом. Затем инкубируйте предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Во-вторых, после инкубации снимите покровную крышку и промокните вокруг ткани салфеткой.

Затем на ткань нанесите 100 микролитров от одного до 1000 рубина авадон, разведенного в SBT. Затем накройте, оберните и инкубируйте предметное стекло, как это сделано с блоком. Наконец, осторожно снимите крышку и промойте затвор.

Используйте три промывки в четырех x SSC T, а затем три промывки в 0,1 XSSC. Каждый этап стирки должен длиться не менее пяти минут. Продолжая следовать протоколу, высушите предметные стекла, промокнув излишки буфера, не касаясь тканей.

Затем поместите салфетку слайдовой стороной вверх в темное место на 10-15 минут или пока влага полностью не рассеется. Теперь установите предметное стекло с помощью 11 микролитров векторного щита с DPI и осторожно опустите защитное стекло без сигма. Если средство не доходит до всех краев, нанесите еще несколько микролитров среды от края и сотрите излишки.

Затем заклейте крышку лаком для ногтей и храните слайд в вертикальном положении в темном месте, пока лак для ногтей высохнет, что обычно занимает не менее получаса. Затем храните предметное стекло при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение недели и как можно скорее сделайте снимк ткани. Набор небольших коммерчески синтезированных олигогенов с флуоресцентными конъюгатами и более длинным биотинилированным зондом, изготовленным компанией Nick Translation, были гибридизированы с хромосомами из нескольких различных типов тканей.

Используя описанную методологию, зонд к спутниковому повтору пары оснований Drosophila Melanogaster 359 распознал большой блок мультимегапар оснований на x и гораздо меньшую область на третьей хромосоме. Более длительный зонд против спутника-ответчика обнаружил повторяющиеся блоки, состоящие из относительно низкого числа повторяющихся копий — около 700. Таким образом, этот метод позволяет визуализировать очень маленькие блоки спутников.

Когда стадия лечения гипотоническим раствором была увеличена в два раза до 10 минут, разделение сестринских хроматид увеличивалось на восток. Эта процедура может быть сочетаться с другими методами, такими как окрашивание антителами, чтобы ответить на такие вопросы, как локализованы ли определенные белки хроматина в определенных последовательностях.