Оценка Selective мРНК перевода в клетках млекопитающих по полисом профилирования

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы провести различие между мРНК с высокой и низкой трансляцией путем иммобилизации и разделения полирибосом. Это достигается путем предварительного добавления циклохейде в клетки для ингибирования их рибосом, транслокации и трансляции РНК. В качестве второго шага лизаты из обработанных клеток загружаются в градиент сахарозы и ультрацентрифугу для разделения хранящихся полирибосом в соответствии с их массой.

Затем градиент делится на равные доли для разделения сильно и плохо переведенных транскрипций на последнем этапе. R-T-Q-P-C-R используется для обнаружения присутствия представляющих интерес мРНК в каждой фракции. В конечном счете, профилирование рибосом может быть использовано для обнаружения изменений в глобальной, а также специфической трансляции мРНК в ответ на различные физиологические и патофизиологические стрессы.

Профилирование PolyOne может ответить на ключевые вопросы в области молекулярной и клеточной биологии, такие как какие мРНК выбираются, транслируются во время S-стресса и как это позволяет клеткам адаптироваться к этим условиям. Чтобы использовать автоматический градиент для приготовления градиента сахарозы, начните с включения градиента и выровняйте пластину, которая будет удерживать градиенты, когда пластина будет выровнена. Нажмите «Готово».

Затем для выбора градиентной программы откройте меню градиента и выберите список. Нажмите на SW 41, а затем прокрутите список, пока не появится программа с градиентом от 10 до 50% и нажмите. Использование. Затем поместите коническую ультрацентрифужную пробирку SW 41 в маркерный блок и с помощью прилагаемого тонкого маркера пробирки проведите линию на пробирке вдоль верхней ступени блока.

Поместите трубки в штатив для фитингов на устойчивую поверхность, а затем прикрепите две предоставленные канюли к двум 10-миллилитровым шприцам. Пипеткой нагрейте дистиллированную воду, содержащую РНК в активационном растворе, вверх и вниз несколько раз промывайте шприцы. Затем, удалив все следы воды, наполните один из шприцев 10% сахарозы плюс циклохейде, и вставьте канюлю на дно ультрацентрифужной пробирки.

Аккуратно дозируйте раствор до тех пор, пока он не пройдет сразу за отметку, сделанную на тюбике. Следите за тем, чтобы не было пузырей. Затем наполните другой шприц 50% сахарозой плюс циклохейде и удалите лишнюю жидкость с тюбика салфеткой.

С помощью канюли осторожно введите 50% раствор сахарозы в трубку, остановившись, когда раствор сравняется с отметкой, а затем быстро и плавно извлеките канюлю. 10% раствор сахарозы должен подняться, образуя мениск в верхней части трубки. Затем слегка наклоните ультрацентрифужную трубку, чтобы удалить пузырьки воздуха, и вставьте колпачок с помощью микропипетки, чтобы удалить лишнюю жидкость из резервуара колпачка.

Поместите трубки на градиентный генератор и затем нажмите кнопку запуска. Обратите внимание, что пластина будет наклоняться под указанным углом. Сделайте паузу на пять секунд, после чего начнутся вращения для формирования градиента.

Примерно через две минуты машина издаст звуковой сигнал, указывающий на то, что формирование градиента завершено. Аккуратно переложите пробирки на решетку и быстро снимите колпачки движением вверх, чтобы не нарушить градиент. Затем аккуратно загрузите равное 260 единиц предварительно подготовленного клеточного лизата на каждый градиент сахарозы и вращайте пробирки в течение полутора часов при температуре 260, 343 G и четырех градусах Цельсия в ультрацентрифуге.

Для настройки системы градиентного фракционирования прибора начните с включения спектрофотометра. Затем дважды нажмите значок папки, а затем дважды стрелку возврата, чтобы вернуться на главный экран и установить коллектор фракций на метод PolyZone, чтобы гарантировать, что клапан на коллекторе фракций настроен на отходы. Нажмите на стрелку, указывающую на значок мусорного ведра, а затем поместите 250-миллилитровую колбу MIA с дистиллированной водой под трубку для сбора отходов.

Теперь выберите следующие настройки на самописце, диск чувствительности, чтобы установить лампу и оптику, шумовой фильтр. Переключитесь на 1,5 пикового диска сепаратора на забортную скорость, установите диференцию на 30 сантиметров в час и базовую линию и отрегулируйте циферблат в верхней части блока спектрофотометра в положение максимальной разомкнутости. Затем поместите шприц и цилиндр в насос и с помощью прилагаемых винтов и Алана Ки затяните его на место.

Используйте команду rev на высокой скорости, чтобы наполнить шприц раствором для погони. Затем установите насос в вертикальное положение и с помощью команды вперед прогоните воздух через трубку. Далее установите в держатель ультрацентрифужную пробирку, заполненную свободной от РНК водой, а затем проткните пробирку канюлей до тех пор, пока не станут видны две черные метки.

Дозирующее отверстие находится между двумя метками. Запустите шприцевую помпу в прямом ручном режиме со скоростью 6,0 миллилитров в минуту. Когда раствор погони заполнит одну треть трубки, переключитесь на переменную скорость с расходом 1,0 миллилитров в минуту.

Теперь поворачивайте диск регулировки базовой линии на спектрофотометре до тех пор, пока напряжение на графике не станет равным нулю. Вода начнет выходить из сливной трубки в колбу el Mya. Затем установите желаемую чувствительность на 1,0 а.е.

Когда чувствительность будет отрегулирована, нажмите кнопку «Также база» и поверните диск смещения регистратора, чтобы отрегулировать настройку базовой линии до отметки 10% на самописце. Затем, как только будет достигнута стабильная базовая линия, выключите переключатель насоса и диск скорости графика. Как только насос выключится, переключите его в положение оборотов, чтобы восстановить раствор для прокалывания, пока он не достигнет первой отметки на канюле для прокалывания.

Затем извлеките трубку центрифуги, диспергируйте все пузырьки в канюле с помощью небольшого количества раствора и очистите остатки воды, которые могли просочиться из проточной ячейки, чтобы фракционировать градиент. Затем установите в держатель центрифужную трубку, содержащую градиент сахарозы, и проткните трубку канюлей. Затем поместите десять двухмиллилитровых микроцентрифужных пробирок в лоток для сбора фракций в положениях со второго по 11, а поясную трубку в первое положение так, чтобы крышки не выступали вверх.

Установите ручное положение ручного управления насосом, а расход на шприцевом насосе на 6,0 миллилитров в минуту. Затем нажмите кнопку воспроизведения на коллекторе фракций, как только рычаг достигнет первой трубки. Нажмите кнопку паузы, чтобы установить положение рычага и открыть клапан дозирования фракций.

Затем с помощью команды forward запустите насос и следите за пером самописца. Когда ручка начнет отклоняться вверх, указывая на то, что образец проходит через проточную ячейку, быстро замените пробирку для отходов на пробирку номер один. Затем, когда первая капля будет собрана, быстро переключите команды на дистанционный запуск, остановку и переменную 1,0 миллилитра в минуту и нажмите кнопку воспроизведения, чтобы интерфейс сборщика дробей мог собирать один миллилитр дробей каждую минуту.

Наконец, после того, как раствор синей погони войдет в последнюю пробирку, нажмите стоп. Профилирование PolyZone является ключевым методом демонстрации специфического участия PD CD4 в опосредованной IRA трансляции. Например, в этом эксперименте клетки HEC 2 93 были временно трансфицированы для истощения эндогенных уровней PDC D 4, а затем подвергнуты анализу профиля PolyZone.

Снижение уровня PDC D 4 не нарушило глобальную трансляцию гена, о чем можно судить по отсутствию изменений в профиле PolyZone. При сравнении контроля SI и IPD CD четырех обработанных клеток аналогичным образом распределение полисом варианта XIAP, не относящегося к IRA, было неизменным между обработанными и необработанными клетками. Напротив, распределение полисом двух ИС, содержащих мРНК XIAP и BCL XL, было значительно изменено.

В отсутствие PD CD4 распределение этих двух мРНК было смещено в тяжелые рибосомы. Поскольку это не сопровождается изменениями равновесных уровней мРНК XIAP и BCL XL, эти результаты демонстрируют усиленную трансляцию XIAP и BCL XL в клетках со сниженными четырьмя уровнями PDC D, что в дальнейшем подтверждается западным цветением. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить трансляцию мРНК путем подготовки области сахарозы и разделения полисом с помощью ультрацентрифугирования.