Выделение и Иммортализация пациента, полученных клеточных линий мышечной биопсии для моделирования заболеваний

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы выделить очищенные мышечные клетки из биопсии мышц пациента и увековечить их для последующих исследований. Это достигается путем предварительного взвешивания, измельчения и переваривания собранной ткани для диссоциации мононуклеарных клеток. На втором этапе миогенные клетки очищаются от немиогенных клеток с помощью фактов.

Затем миогенные клетки заражаются как CDK 4, так и H. turt для создания иммортализованных клеток. Результаты показывают, что живые мышечные клетки, полученные от пациента, могут быть расширены в течение нескольких пассажей и дифференцированы на основе анализов слияния клеток, наличия подергивающихся миотрубков и экспрессии миогенных маркеров. Применение этого метода выходит за рамки диагностики мышечных заболеваний, поскольку он потенциально может обеспечить неограниченное количество миогенных клеток для скрининга лекарств или других последующих применений, где требуется большое количество клеток.

Я продемонстрирую эту процедуру вместе с Джеромом Роббином, постдокторантом из лаборатории доктора Вуди Райта в Далласе. Начните с диссоциации биопсии мышц для очищения миогенных клеток. Сначала в культуре ткани биозащитный капюшон, запишите массу биопсии мышцы.

Далее в 10-сантиметровой посуде с помощью стерильных скальпелей измельчите ткань на мелко нарезанные кусочки. Добавьте несколько капель одного X-H-B-S-S, чтобы ткань не пересыхала на грамм ткани. Добавьте 3,5 миллилитра дисковой пасты два и 3,5 миллилитра растворов коллагеназы D.

Затем перемешайте клетки с помощью пипетки объемом 25 миллилитров и каждые 15 минут перекладывайте пластину в инкубатор. Смешайте клетки с помощью пятимиллилитровой пипетки в течение 90 минут. Должна произойти полная диссоциация тканей.

После того, как ткань будет диссоциирована, добавьте два объема питательной среды и отфильтруйте ее через ситечко 100 микрон. Соберите фильтрат в пробирку объемом 50 миллилитров. Гранулируйте ячейки из фильтрата при 329 G в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем повторно суспендируйте клетки в HBSS с 0,5% BS, A и подсчитайте их. Отрегулируйте объем, чтобы получить 1 миллион клеток на 100 микролитров. Отложите аликвоту на 250 000 клеток в качестве неокрашенного контроля и отложите две аналогичные аликвоты для контроля одиночного окрашивания.

Все это необходимо для анализа факса. Теперь окрасьте клетки пятью микролитрами антител против CD 56 на миллион клеток и инкубируйте все образцы на льду в течение получаса. Далее быстро промойте образцы 10 миллилитрами HBSS.

Затем гранулируйте клетки, как и раньше, но при четырех градусах Цельсия после того, как клетки были гранулированы, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном X-H-B-S-S при 5 миллионах клеток на миллилитр. Затем добавьте йодид пропидиума до конечной концентрации один микрограмм на миллилитр. Теперь очистите миогенные CD-56-положительные клетки от немиогенных клеток, используя факты, следующие за очищающей пластиной.

Миогенные клетки по 50 000 в лунке в шести лунках покрывают культурой 0,1% желатина, клетки до тех пор, пока они не прикрепятся, затем заражают их вирусом для клеточной линии Immortal. В текстовом протоколе содержится дополнительный обзор того, как очищать и культивировать дермальные фибробласты, как описано в текстовом протоколе. Подготовьте тропные клетки феникса после инкубации тропических клеток феникса в течение ночи с плазмидной смесью PolyJet.

Скармливайте клетки свежей, средней, состоящей из четырех частей ДМО М1, части среды, 1 99 и 10% телячьей сыворотки. Также подготовьте инотропную упаковку. PA три 17 ячейки в шестилуночной пластине с примерно 400 000 PA три 17 ячейки на лунку.

Через 12 часов соберите вирус, содержащий надосадочную жидкость, над тропическими клетками Феникса и пропустите его через фильтр размером 0,45 микрона. Затем с помощью одного миллилитра надосадочной жидкости заразить три клетки ПА и культивировать их в течение ночи. На следующий день выберите для вирус-продуцирующей клеточной линии из ПА три 17 клеток, применяя антибиотики в дозе 0,5 мг на миллилитр к среде, когда клетки близки к беглости, соберите надосадочную жидкость из клеток три раза с интервалом в 12 часов.

Фильтруйте коллекции после каждого сбора урожая. Фильтрат является рабочим вирусным надосадочным веществом. Разделите его на один миллилитр. Аликвоты.

Отложите несколько аликвот для немедленного использования. Дополнительные аликвоты можно хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию, но они будут терять 50% эффективности с каждым циклом замораживания и оттаивания. Обратите внимание, что на протяжении всего технологического процесса оборудование, с которым соприкасались вирусные частицы, должно быть промыто отбеливателем, прежде чем выбрасываться в мусорное ведро.

Чтобы постоянно хранить стабильную клеточную линию, продуцирующую вирус PA 3 17, заморозьте клетки в сыворотке 10% ДМСО 90% и храните их при температуре минус 150 градусов Цельсия в каждой лунке очищенных клеток. В шестилуночную пластину добавьте 400 микролитров свежеобразовавшегося вирусного надосадочной жидкости. Оставьте две лунки без вируса в качестве контроля.

Инкубируйте тарелку в течение ночи и на следующий день меняйте среду в каждой лунке до 2,5 миллилитров свежей мышечной среды. Обязательно выбросьте в контейнер для отбеливателя фильтрующие материалы и пипетки, содержащие вирусные частицы. Дайте клеткам инкубироваться в свежей мышечной среде в течение трех дней.

Затем выберите клетки на устойчивость к антибиотикам, используя 400 микрограммов неомицина на миллилитр для инфекции CDK 4 или 300 микрограммов гигромицина на миллилитр для теломеразы человека. Инфекция обратной транскриптазы в течение недели или двух. Поддерживайте клетки в условиях отбора до тех пор, пока все клетки и контрольные лунки не будут мертвы.

Всегда пропускайте клетки до того, как они сливаются, даже во время отбора, когда они достигают беглости от 60 до 80% Co, используйте 0,05% раствор трипсин ЭДТА для сбора и прохождения клеток. Пропустите клетки в 10-сантиметровые посуды со свежим миобластом, срединные с антибиотиками. Сначала засейте клетки с очень низкой плотностью от трех до 500 на 10-сантиметровую чашу.

Поддерживайте клетки в этих чашках в течение примерно двух недель, пока не сформируются небольшие колонии от 10 до 20 клеток, когда маленькие колонии станут очевидными. Удалите большую часть среды, оставив только тонкую пленку среды, чтобы ячейки не высыхали. Теперь окуните одну сторону кольца для клонирования в силиконовую вакуумную смазку и направьте кольцо на желаемый клон.

Поместите отдельное кольцо вокруг каждого желаемого клона в каждом кольце. Добавьте несколько капель раствора трипсина ЭДТА. Когда клетки округляются, с помощью микроскопа осторожно отсасывайте каждый шарик клеток в наконечник для пипетки объемом 200 микролитров.

Переложите шарики ячейки в лунки наименьшей доступной многолуночной пластины. Затем расширьте каждый клон по мере необходимости, чтобы предотвратить беглость речи. С помощью описанного протокола миогенные клетки были выделены вместе с фибробластами, адипогенными клетками и, возможно, иммунными клетками, а затем очищены фактами.

Затем клетки были иммортализированы, как описано, с использованием вирусов, экспрессирующих циклин-зависимую киназу 4, CDK 4 и теломеразу обратной транскриптазы человека. Было крайне важно, чтобы чашки были менее плавными на каждом этапе, так как они могли войти в программу дифференцировки и образовать миотрубки, сравнивая образование и сокращение миотрубков в неиммортализованных контрольных клетках и иммортализированных клетках. Никаких различий замечено не было.

Бессмертность клеточной линии была подтверждена измерением длины теломер и активности теломер. Бессмертный также был очевиден по кривым роста клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как диссоциировать первичные мышечные клетки от биопсии пациента.

Увековечить первичный миобласт и изолировать и отобрать увековеченные миогенные клоны. Не забывайте, что работа с вирусом требует использования специальной тканевой культуральной культуры и безопасной системы вентиляции. Кроме того, все, что связано с манипуляциями с вирусом, такое как пипетки, наконечники, посуда, шприцы и фильтры, должно быть отбелено, чтобы избежать любого нежелательного заражения.

Вирусные частицы могут быть опасными, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.