В пробирке функциональные характеристики мыши колоректального афферентных окончаний

Общей целью данного эксперимента является функциональная характеристика внешних афферентных нервных окончаний в прямой кишке мыши in vitro. Это достигается путем забора колоректального и прикрепленного тазового или поясничного шейного нерва Splunk в континууме и помещения ткани в камеру записи in vitro. В качестве второго шага ствол тазового или поясничного нерва Splunk разбивается на тонкие нити, чтобы можно было проводить электрофизиологические записи отдельных аксонов нерва с помощью одного волокна. Затем отдельные колоректальные нервные окончания идентифицируются с помощью несмещенной электрической стимуляции рецептивных полей и функционально классифицируются на основе профилей реакции на три различных механических стимула.

Кроме того, реакцию на химические вещества, действующие на нервные окончания, можно проверить, изолировав рецептивное поле куском латунной трубки и заменив раствор раствором, содержащим химическое вещество или смесь химических веществ. Результаты показывают, что колоректальный мышь иннервируется пятью различными классами механочувствительных энс. Кроме того, около 25% колоректальных энов являются механически нечувствительными или молчащими ноцицепторами.

Этот метод используется нами и другими для изучения сенсорной иннервации колоректального кишечника. Мы заинтересованы в использовании этого исследовательского подхода, потому что многие желудочно-кишечные расстройства связаны с сенсибилизацией или изменением возбудимости сенсорной иннервации. Наш интерес к пониманию механизмов сенсибилизации связан с нашим желанием помочь в разработке терапевтических стратегий, которые затем могут быть полезны для модуляции боли и дискомфорта, обычно связанных с этими желудочно-кишечными расстройствами, такими как синдром раздраженного кишечника.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы рассечения тканей и расщепления нерва очень сложны для освоения. Нервы внедряют инновации. Дистальный отдел толстой кишки может быть легко поврежден во время диссекции.

Таким образом, тщательное препарирование и этапы расщепления действительно важны для тех, кто хочет повторить этот эксперимент. Сразу после усыпления мышь обескровливают ее, разрезают грудную камеру, пробивают правое предсердие и погружают тушку мыши, а также примерно пол-литра ледяного раствора Creb. Далее аккуратно удалите все внутренности, кроме толстой кишки и органов малого таза.

Затем пересеките тело мыши в точке около T 12 немного выше грудной диафрагмы и перенесите половину тела в камеру для вскрытия, содержащую ледяной раствор пузырькового крепа. Под стереоскопом удаляют мочевой пузырь и репродуктивные органы, пересекая в местах их соединения в мочеиспускательный канал. Кроме того, удаляют нисходящую аорту до тех пор, пока она не разветвится на общие подвздошные артерии.

Теперь освободите тазовые или поясничные нервы шеи от окружающих тканей. Следуйте за нервами от наружной части подвздошного гребня до точки их входа в позвоночный столб. Тазовые нервы входят в L шесть и S один позвоночный столб, а поясничные планковые нервы входят в T 13 и L 1

Здесь проводится рассечение левого и правого тазовых нервов. Далее разрежьте лобковый синтез и разрежьте правый и левый вертлужные суставы. Затем удалите подвздошную кость После удаления подвздошной кости рассеките дистальный отдел толстой кишки с прикрепленным свободным нервом.

Прикрепляется нерв из окружающей мышцы и соединительной ткани. Нерв подвержен механическим повреждениям. Мы освобождаемся от окружающих нас тканей, поэтому необходимо проявлять особую осторожность, чтобы не растянуть или не защемить нерв.

Затем переносят колоректальный с прикрепленным нервом в тканевую камеру. Раскройте колоректальный участок в продольном направлении вдоль антибрыжеечной границы и расположите колоректальную слизистую оболочку вверх. Затем протяните нерв в отсек для записи, который соединен с отсеком для ванны мышиной норой и воротами.

Расположите нервный ствол на маленьком стеклянном зеркале. Зеркало гидрофильное и нерв будет к нему прилипать. Теперь рядом с отсеком для записи прижмите брыжеечный край толстой кишки.

Теперь добавьте в ванну теплый кислородный раствор Creb и наполните отсек для записи минеральным маслом, чтобы завершить настройку. Прикрепите антибрыжеечную длину колоректальной мышцы к граблям из крючков, соединенных с силовым приводом под стереомикроскопом при большом увеличении. Осторожно отклейте нервную оболочку от изолированного тазового или поясничного нерва шейного отдела с помощью тонких щипцов.

Разразните нервный ствол на пять-восемь нервных пучков, каждый из которых имеет толщину около 100 микрон. Теперь поместите электрод сравнения в контакт с раствором Кребса в тканевую камеру. Затем последовательно расположите отдельные нервные пучки на записывающем электроде, чтобы вызвать потенциалы действия от колоректального энса.

Аккуратно погладьте толстую кисть с помощью мягкой кисти. Таким образом идентифицируют нервный пучок или пучки, которые иннервируют толстую кишку. Теперь, используя пару наконечников игл 30 калибра, разделите нервный пучок на нити толщиной 10 микрон и поместите одну из нитей на записывающий электрод.

Этот шаг требует высокого уровня координации глаз и рук и ловкости. Затем для электрического возбуждения афферентных нервных окончаний расположите концентрический электрод с круглым наконечником перпендикулярно поверхности слизистой оболочки и стимулируйте с надпороговой интенсивностью. Это создает распределение тока в радиусе двух миллиметров.

Чтобы найти рецептивные окончания, систематически перемещайте электрод с шагом 1,5 миллиметра по длине и ширине сплющенной прямой кишки. Когда афферентный конец возбуждается, отрегулируйте положение электрода и интенсивность стимула, чтобы точно определить рецептивное поле, которое требует наименьшей интенсивности стимула для ответа. Если порог стимула превышает три миллиампера, откажитесь от этого нервного окончания и перейдите к изучению другой нервной нити.

Теперь рассчитайте скорость проводимости по расстоянию между стимулирующим электродом в рецептивном поле и месте записи, а также по задержке проводимости между артефактом стимула и началом потенциала действия. После определения местоположения рецептивного поля с помощью электрического раздражителя примените три механических стимула. Во-первых, примените зондирующий стимул, надавливая на кончик откалиброванной фон нити, как нейлоновую мононить, перпендикулярно в сторону рецептивного поля на сплющенной толстой кишке.

Используйте мононити, которые производят усилие 0,4 грамма и один грамм. Во-вторых, создайте поглаживающий стимул, осторожно поглаживая слизистую оболочку толстой кишки тонкой нейлоновой нити, создавая силу в 10 миллиграммов для создания небольшого поверхностного напряжения сдвига в рецептивном поле. В-третьих, проведите круговое растяжение с помощью управляемого компьютером силового привода.

Пусть он подает натянутую силу наклона в окружном направлении вдоль антибрыжеечного края толстой кишки. Теперь классифицируем ЭНС как серозную, слизистую мышечную, мышечную, слизистую или MIAA, механически нечувствительную афферентную. По результатам трех испытаний.

Начните с записи базовой реакции на механический раздражитель, как и в предыдущем разделе, с помощью наклонного окружного, растягивающего или перпендикулярного механического зондирования для проверки химической чувствительности. Сначала покройте нижний край трубки из латуни или нержавеющей стали нефтью и поместите его над восприимчивым полем на толстой кишке. Теперь отсасывайте раствор Кребса изнутри трубки и замените раствор 170 микролитрами тестового раствора.

Оставьте трубку в нужном положении на три-пять минут, отслеживая реакцию афферента. Сразу после удаления трубки в течение четырех-шести минут проверьте афферентную реакцию на тот же механический раздражитель, что и при исходной реакции. Через 15 и более минут реактивы можно считать вымытыми.

Затем снова прикладывается механический раздражитель. Для сравнения с исходными муравьями, рассеченный нерв стимулировали для поиска рецептивного поля. Рецептивное поле определяли по реакции потенциала действия с использованием задержки проводимости потенциала действия.

Расчетная скорость проводимости составила 43 метра в секунду, что находится в пределах немиелинизированного С-волокна. После идентификации рецептивного поля его зондировали перпендикулярно с помощью портативных фон фрай, как мононити, а также мягко поглаживали с помощью ручной тонкой нейлоновой нити. Реакция AFR на зондирование также оценивалась с помощью управляемого компьютером силового привода, который подает в тот же участок на колоректальном участке серию точно рассчитанных и воспроизводимых механических сил.

Аналогичным образом, окружное растяжение толстой кишки осуществлялось тем же усилием привода. Реакции могут быть различимы на основе реакций на зондирование, поглаживание и растяжение чувствительного афферента к растяжению были вызваны тремя последовательными круговыми растяжками с интервалом в пять минут. Числа спайков были равномерно закреплены и отображены в виде функций реакции на стимул, что свидетельствует о высокой воспроизводимости, а также величине и пороге отклика.

Далее были применены химические препараты. Прямая активация энс происходила после применения кислотного гипертонического раствора после применения воспалительного супа к механически нечувствительному афференту. Активации окончания не произошло, но приобретение меночувствительности было очевидным

Чувствительный к растяжению, меночувствительный афферент также был сенсибилизирован к механическому растяжению рецептивного поля после применения воспалительного супа После освоения обычно требуется три-четыре часа, чтобы завершить рассечение ткани и добиться записи одного волокна. Типичный эксперимент занимает целый день от начала до конца. После просмотра этого видео вы должны понять, как удалить и собрать колоректальный слой с прикрепленными нервами.

Затем вы сможете записывать данные из одиночных волокон Ахерна либо в тазовом нерве, либо в поясничном нерве, иннервируя толстую кишку с помощью стратегии несмещенного электрического поиска. Затем вы должны быть в состоянии идентифицировать рецептивные окончания в прямой кишке и проверить их на механическую чувствительность, а также чувствительность к химиотерапии, применяя химические вещества непосредственно к рецептивным окончаниям. Данный препарат является мощным препаратом, позволяющим изучить патофизиологические механизмы, а также основные физиологические вопросы в колоректальном организме.