Вскрытие и Монтаж Drosophila Куколочные глаз Диски

Добро пожаловать на вскрытие межпозвоночного диска зрачка глаза и монтаж дрозофилы меланогастер. Следует выбирать куколку с соответствующей степенью БГ. Рассечение начинается с прокалывания зрачкового корпуса и извлечения куколки из корпуса.

Надрез делается по диагонали середины грудной клетки в области куколки. После разрезания куколки мозг и IIS будут изолированы и обработаны перед установкой IIS. Для микроскопии начинается процесс вскрытия и соответствующего возраста выбирается куколка.

Поместите куколку в большую каплю PBS на препарирующую тарелку. Лучше всего ориентировать куколку крючками для рта вниз. Это крючки для рта, обращенные к крючкам для рта вниз.

Аккуратно обхватите куколку одной парой щипцов. Будьте осторожны, чтобы не выдавить развивающуюся куколку внутрь зрачкового корпуса слишком сильно с помощью острых щипцов. Проткните корпус зрачка и позвольте четырем ступеням разойтись, чтобы оторвать конец.

Протяните руку внутрь и вытащите развивающуюся куколку из только что созданной ямы. Затем возьмите ножницы и разрежьте куколку примерно до середины грудной клетки. Сделайте разрез по диагонали.

Тогда лучше всего удалить мусор или перенести ПУ вперед на новую каплю PBS. Очистку можно проводить с помощью трубки воздуходувки для дозатора, а при необходимости следует добавлять дополнительную PBS, стараясь не допустить обезвоживания. Далее надежно захватите верхнюю часть головки зрачка кутикулой с помощью щипцов.

Убедитесь, что вы не захватываете какую-либо ткань внутри кутикулы кончиком трубки воздуходувки. Осторожно надавите на зрачок, чтобы выдавить мозг и прикрепить глазной диск из зрачка. Чтобы помочь в этом процессе, используйте PBS в трубке воздуходувки, чтобы аккуратно выдуть мусор, как показано здесь, из корпуса головки, чтобы обеспечить четкое разделение и идентификацию диска мозга и I, продолжайте этот процесс проталкивания и продувания по мере необходимости до тех пор, пока мозг и диски I не будут отделены от окружающих тканей и легко идентифицированы. уже начался, и I дисс имеет легкий цвет.

Глазные диссы обведены красным цветом, а мозг выделен между ними. При большем увеличении каждый I диск может быть легко идентифицирован. Опять же, I-образные диски обведены красным цветом с мозгом между ними.

Мозг и внутримышечные диски должны оставаться очищенными и отделенными от оставшейся ткани с помощью щипцов и воздуходувной трубки оптимальным образом, глазной диск и мозг должны оставаться прикрепленными к кутикуле головы, чтобы он мог выступать в качестве ручки для щипцов для будущих манипуляций. Несмотря на то, что в процессе выдувания и надавливания обычно происходит смещение диска мозга и глаза из кутикулы головы. После тщательной изоляции I диса и головной мозг аккуратно помещают ткань в фиксированный раствор.

Первоначально позвольте I-образному диску плавать на верхней части фиксатора, чтобы он не рухнул сам по себе и не зафиксировался В закрытой ориентации лучше всего рассечь I dis и позволить им плавать на фиксации. Они остаются плавающими, пока следующий набор дисков I не рассекается, а затем погружаются в фиксацию после фиксации диска I. Они обрабатываются по мере необходимости, например, для иммуноокрашивания, а затем устанавливаются на предметное стекло для визуализации.

Здесь зафиксированы зрачки I дисков с мозгом, все еще прикрепленным к большой капле PBS. Монтаж и глицерин сделать очень сложно, хотя мы успешно смонтировали iis и 50% глицерин и PBS. Если вы монтируете в PBS, обязательно избегайте обезвоживания.

Обратите внимание, что кутикула головы была удалена. Красным цветом обведен каждый I диск. Мозг выделяется между ними.

Возьмите острые щипцы и разорвите связь между глазным диском и мозгом. Это достигается путем удержания мозга и размещения острых щипцов в месте соединения здесь. Это может быть очень сложно.

Важно использовать острые щипцы, потому что они значительно облегчают этот процесс. Также можно сделать это разделение с помощью тонкой рассекающей иглы, как это видно. Иногда легче оторвать мозг, стабилизируя глазной диск в месте соединения.

На этом глазном диске осталось довольно много посторонней ткани, которая не должна влиять на визуализацию глазного диска, если I-образный диск установлен на предметном стекле микроскопа этой стороной вверх. Это позволяет сделать апикальную поверхность диска I плоской на предметном стекле микроскопа. Мы установили, что дальнейшее удаление этой ткани обычно приводит к повреждению тканей I диска.

Поэтому предпочтительно оставить эту ткань и избегать ее на стадии визуализации. Другой метод удаления мозга включает в себя прикрепление глазного диска к месту соединения либо иглой, либо острыми щипцами, как показано здесь, а затем вытягивание мозга. Эта отслойка была намного чище, на I-образном диске оставалось меньше ткани.

Когда вы закончите подготовку всех дисков I, выровняйте их в ряд так, чтобы оптическая дорожка была направлена вверх. Снимите PBS и замените его защитным экраном VTA или другим монтажным материалом и закройте их защитным колпачком. Теперь диски I уровня готовы к визуализации с помощью описанных здесь методов, а также подробного протокола иммуноокрашивания.

В рукописи I диск может быть визуализирован с помощью конфокальной микроскопии для определения морфологических характеристик, как показано здесь с помощью окрашивания фосфотирозином, что выявляет апикальную морфологию омельных клеток в I диске. Другие антитела и генетические методы могут быть использованы для идентификации клеточных трубок и паттернов экспрессии, как показано здесь для экспрессии разрезанного транскрипционного фактора в колбочках диска I. Это видео представляет собой ремастеринг обучающих видеороликов, которые были созданы для обучения студентов бакалавриата этой технике.

Многие из наших учеников были успешно обучены этой технике с помощью этого видео, и мы надеемся, что оно поможет и вам. Мы желаем вам удачи в ваших экспериментах и надеемся, что эта методика принесет вам пользу.