Исследуя распространение и токсичности прионами как белков с использованием многоклеточных животных модельного организма C. Элеганс

Общая цель следующих экспериментов состоит в том, чтобы изучить распространение и комплексную токсичность PreOn-подобных белков с использованием модельного организма С-элегантности многоклеточных. Это достигается за счет мониторинга внутриклеточного и внутриклеточного транспорта везикул, содержащих белок, подобный PreOn, с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии. Далее тканевые специфические датчики сворачивания и повсеместно выраженное напряжение.

Репортеры используются для оценки влияния автономных и неклеточных автономных клеток на клеточную приспособленность. Затем проводится полногеномный скрининг РНК-интерференции с целью выявления новых модификаторов токсичности, вызванной PreOn. Экран проводится в жидкой культуре с использованием взбивания в качестве считывания токсичности.

Наконец, червячный трекер A плагин для изображения J используется для количественной оценки движения C elegance в комбинации. Эти методы позволяют отделить генетические пути, участвующие в межклеточном движении белков, подобных PreOn, и их неклеточную автономную токсичность. После подготовки синхронизированных трансгенных линий sea elegance control и PreOn домена и 10% прокладок агроса, согласно сопроводительному текстовому протоколу, пипеткой три микролитра 100 нанограмм полистирольных шариков и три микролитра четырехмиллимольного лимассола в прокладку агроса.

Используя платиновую проволоку, переведите червей нужного возраста с планшета в раствор и используйте покровный лист для изображения червей на субклеточном уровне. Поместите предметное стекло в держатель предметного стекла конфокального микроскопа и используйте масляный объектив 63 x или 100 x 1,4 NA. Далее откройте METAMORPH и выберите многомерное получение.

А под главной вкладкой установите флажки для журналов замедленной съемки и прогона. На вкладке сохранения выберите или создайте папку каталога для сохранения файлов и назначьте имя файлу На вкладке длины волны используйте четырехугольный красный цвет Yoko или эквивалентную подсветку изображения MRFP и отрегулируйте экспозицию в диапазоне от 100 до 300 миллисекунд и усиление камеры в диапазоне от 100 до 300. Затем на вкладке замедленной съемки установите временной интервал равной одной секунде, продолжительность — пять минут, а количество временных точек — 301.

Под вкладкой журналов. Для журнала выберите A FC set, Z hold и A FC return to Z hold for type select special дважды, а для начальной точки выберите начало временной точки и конец временной точки. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как приложения для отслеживания частиц, для измерения динамических свойств диска.

После синхронизации трансгенных нематод прионного домена и нематод while и копирования библиотечных планшетов inger RNAI в соответствии с текстовым протоколом, инкубируйте дублированные пластины РНК-интерференции при температуре 37 градусов Цельсия и 300 об/мин для использования одной бактерии HT 15 E coli, содержащей пустой вектор L 4 4 4 0 в качестве контроля. Вырастите его отдельно в культуральной пробирке, а затем с помощью многоканальной пипетки перенесите 65 микролитров культуры в одну четверть лунок из 2 96. Луночные планшеты с автоматизированным рабочим местом, содержащим многоканальный напор

10 микролитров пяти, миллимоляров разведенного IPTG в каждую лунку РНК-интерференции бактерий и контрольных планшетов. Запечатайте их перед инкубацией в течение трех часов, пока бактерии инкубируются. Смешайте синхронизированный контроль дикого типа и трансгенные личинки L one и M 9, хорошо буферизуйте и пипеткой от 5 до 10 микролитров на стеклянный микроскоп.

Посчитайте на слайде червей и рассчитайте количество червей на микролитр. После трехчасовой бактериальной инкубации выньте пластины из инкубатора и дайте им нагреться до комнатной температуры, чтобы избежать теплового стресса для червей. Далее дополните буфер М 9 холестерином IPTG и антибиотиками согласно текстовому протоколу.

И добавьте соответствующий объем раствора трансгенного червя домена PreOn до конечной концентрации 15 червей на микролитр смеси для равномерного распределения. Затем распределите по 50 микролитров в каждую лунку РНК-интерференционных пластин и лунки одной из пустых контрольных пластин вектора. Налейте раствор червей дикого типа во вторую контрольную пластину.

Затем оставьте все пластины открытыми, чтобы обеспечить аэрацию и предотвратить испарение жидкой культуры, сложив четыре-пять пластин вместе, обернув их влажным бумажным полотенцем, а затем алюминиевой фольгой. Инкубируйте планшеты при температуре 20 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту в течение четырех дней. Для работы с пластинами используйте камеру Falcon four M 60, подключенную к компьютеру с монитором, чтобы визуально выявить повышенное измельчение по сравнению с трансгенными животными, обработанными контрольным доменом PreOn.

Основное преимущество использования автоматизированной рабочей станции для работы с жидкостями для дозирования червей в планшеты R RNAi заключается в том, что это значительно снижает изменчивость и количество червей в лунке. Для проведения анализа подвижности на твердых планшетах и валидации клонов-кандидатов на РНК-интерференцию выращивают РНК-интерференционные бактерии в течение ночи в соответствии с текстовым протоколом. Затем используйте одну миллимолярную IPTG для индуцирования экспрессии DS РНК в течение трех часов.

Используйте по 150 микролитров каждого бактериального клона РНК-интерференции для посева предварительно подготовленных пластин NGM, распределив их тонким слоем. Дайте бактериям высохнуть в течение двух дней при комнатной температуре в темноте под стереомикроскопом. Определите количество синхронизированных червей и суспензии, как описано выше, и добавьте от 25 до 30 л одной личинки в каждую экспериментальную пластину.

Инкубируйте нематод при температуре 20 градусов Цельсия в течение четырех дней, пока черви не достигнут. Второй день взрослой жизни, чтобы количественно оценить подвижность червей, включите камеру и простое программное обеспечение для визуализации PCI. Нажмите на значок камеры, чтобы включить настройку условий изображения.

Далее настройте условие визуализации следующим образом. Установите усиление в режим нулевой освещенности, индекс высокой скорости на единицу и биннинг на два. Затем нажмите кнопку реального времени и автоматическую экспонирование и отрегулируйте условия освещения, перемещая зеркала микроскопа, диски яркости и контрастности.

Нажмите на время, отсканируйте и введите в папку и имя файла, установите в поле задержку на 20 миллисекунд и остановку на время на 30 секунд. Нажмите кнопку «Просмотр в реальном времени», чтобы выбрать область пластины для записи. Затем постучите по тарелке три или четыре раза на сцене.

Быстро подтвердите его положение в поле зрения и нажмите «Старт» после окончания записи фильма, щелкните правой кнопкой мыши по изображению и выберите «Экспортировать последовательность монтажа», чтобы экспортировать фильм из формата CXD в файл A VI. Чтобы проанализировать видео с подвижностью, откройте изображение J, выберите вкладку плагинов, затем выберите Worm Tracker и выберите Worm Tracker batch, а также выберите директорию, содержащую все файлы для анализа, в главном окне ввода Worm Tracker batch загрузите входные значения, как описано здесь. Пояснение к каждому из параметров можно найти в инструкции, которая прилагается к плагину.

Нажмите OK и дождитесь выполнения анализа движения. Наконец, чтобы проверить результаты, убедитесь, что все обнаруженные следы принадлежат истинной морской элегантности, и устраните артефакты. Откройте файлы TXT, созданные для каждого фильма, и скопируйте информацию в файл программного обеспечения для анализа данных.

Откройте созданные zip-файлы этикеток и запустите получившиеся метки TIFF для ручной проверки и устранения ложных следов червей. Йесперу Петерсону, бывшему постдоку в лаборатории, впервые пришла в голову идея отслеживания червей в качестве замены нашей ручной оценки кристалла CL Elegance motil, который представляет собой считывание токсичности. Трекер червей позволяет нам проводить эти эксперименты в автоматическом режиме без предвзятости пользователя, оценивая при этом больше условий за более короткий промежуток времени с помощью покадровой визуализации.

RFP пометил R two E two, который накапливается в трубчатых везикулах, был замечен транспортируемым внутри и между клетками с помощью коэкса, экспрессирующего складной сенсор или репортер напряжения. Вместе с клеткой, подобной PreOn, можно оценить автономные и неклеточные автономные эффекты. Экспрессия R two E two в мышечных клетках приводит к более раннему началу агрегации Q 44 в кишечнике, показывая, что R two E two оказывает неклеточное автономное воздействие на протеостаз Коэкспрессия R two E two С помощью SOD 3 PGFP Транскрипционный репортер окислительного стресса приводит к повышению регуляции репортера в различных тканях. демонстрируя, что домен PreOn индуцирует реакцию на окислительный стресс вне клеток автономно после всего скрининга генома.

Этот фильм демонстрирует, что изображение и визуализация с высоким разрешением на экране компьютера позволяют одновременно просматривать одну четверть тарелки После освоения протокол скрининга может быть выполнен в 12 раундов по 25 тарелок за сеанс. Если проводить два сеанса в неделю, то в течение шести недель можно провести скрининг всей библиотеки РНК-интерференции. Для количественной оценки подвижности C-элегантности был использован червячный трекер, как показано на рисунке.

Worm Tracker преобразует оригинальное видео в двоичный формат, и каждому червю присваивается трек. Обработанные видео можно просматривать с наложенными дорожками, чтобы вручную устранить любые артефакты. Параметр длины тела в секунду нормализуется для разницы в размерах потенциала. Нематоды.

Этот метод идентифицировал 35 супрессоров индуцированной токсичности PreOn, которые увеличивали фенотип подвижности по меньшей мере до 133% и до 256% по сравнению с контрольными червями, обработанными ими. При аренде трекера червей важно не забывать вручную проверять полученные следы червей. Программное обеспечение отлично справляется с идентификацией червей, но иногда фон все же можно ошибочно идентифицировать как животное.

Поэтому не забывайте проверять свои видео после запуска на них червячного трекера. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области нейродегенеративных заболеваний, такие как способен ли определенный белок, связывающий заболевание, распространяться от клетки к клетке, аналогично этому, или существует ли связь между межклеточной передачей и сложной токсичностью этих белков. Детишки.